銀杏葉提取物治療肺纖維化的作用機制

潘玲，盧岳虹，宋策，譚玉萍，梁愛武，楊益寶，楊紅梅， 梁煒，姚平，馮玉青，羅美群，蘇齊鑒

（廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，廣西 南寧 530011）

纖維化是一種原因不明的慢性間質性肺疾病。其病理特征主要為肺成纖維細胞的不斷增生及細胞外基質過度沉積，造成肺組織結構的破壞，最終導致慢性呼吸衰竭[1-2]。目前,肺纖維化無確切有效的治療方法。銀杏葉提取物（ginkgo biloba extract, GBE）是從銀杏葉中提取的一種化合物，具有抗氧化、清除自由基、抗炎及抑制細胞凋亡等多種作用[3-4]。本文通過對近年來有關GBE治療肺纖維化的研究進行綜述，探討GBE治療肺纖維化的作用機制。

1 GBE通過改善氧化應激發揮抗纖維化作用

肺臟由于其結構位置及生理功能的特點，極易受到氧化應激的外源性影響。越來越多的研究表明，氧化應激與肺纖維化的形成密切相關，氧化與抗氧化失衡是肺纖維化重要發病機制之一[5]。活性氧（reactive oxygen species, ROS）作為氧化應激的重要產物，通過調節細胞因子和生長因子的表達，降低抗氧化防御能力，促進氣道上皮細胞凋亡，引發炎癥；進而沉積膠原，導致纖維化產生。還原型煙酰胺嘌呤二核苷酸氧化酶（non-phagocytic cell oxidase, Nox）是調節初級ROS產生的一類獨特的酶。Nox-2、Nox-4在纖維化患者中選擇性上調。負調節核轉錄因子E2相關因子2（NFE2-related factor 2, Nrf2）是氧化應激的關鍵調節因子，Nrf2缺失促進纖維化的發生。谷胱甘肽過氧化物酶減少也會引起氧化應激反應[6]。脂質過氧化物丙二醛（malondialdehyde, MDA）是脂質過氧化損傷后的最終產物之一，其含量可反映細胞和機體受氧化的程度。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）是重要的抗Nox，具有清除氧自由基、保護細胞質膜免受損傷的作用，其含量可間接反映機體抗氧化的能力[7]。 因此，清除氧自由基，提高肺組織抗氧化能力，可作為防治肺纖維化發展的重要措施之一。

GBE中黃酮類作為天然的抗氧化劑，具有清除氧自由基以及清除超氧陰離子及一氧化氮等藥理作用。李無雙等[8]和宋軍等[9]的研究表明，GBE可抑制大鼠中MDA的產生，使含量降低；同時使SOD活力增強，抑制氧自由基反應，阻止脂質過氧化，直接發揮抗氧化作用；還可增加谷胱甘肽水平，下調環Nox-2基因表達，激活抗氧化應激因子Nrf2的表達。這些結果證明GBE具有抗氧化應激作用，對肺間質纖維化具有一定的預防和治療作用。

2 GBE通過抑制細胞凋亡發揮抗肺纖維化 作用

細胞凋亡是機體細胞受到一系類刺激后，在基因的調控下所發生的一種死亡。凋亡發生時，細胞發生收縮，細胞質及染色質濃縮，胞膜內陷形成凋亡小 體[10]。細胞凋亡通路包括內源性途徑和外源性途徑：內源性途徑最重要的環節為線粒體中釋放出來的細胞色素C；此外，線粒體還釋放ROS、凋亡誘導因子等相關分子，共同參與細胞凋亡。當接受凋亡信號后，導致跨膜電位下降甚至喪失，最終崩解線粒體；外源性途徑中，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteine aspartic acid specific protease-3,Capase-3）被認為是細胞凋亡過程中必不可少的基因，當Caspase-3被激活后，細胞凋亡則不可避免[11]。有研究證實，肺泡上皮細胞及支氣管上皮細胞的過度凋亡，阻礙正常上皮化生，成纖維細胞和肌成纖維細胞不斷增生，以及清除肺凋亡細胞時持續的炎性狀態導致清除機制障礙，這些都是造成膠原蛋白沉積的原因，在肺纖維化的形成過程中有著重要作用[12]。因此，促進細胞凋亡對抗肺纖維化有重要意義。

艾衛敏等[13]研究發現，GBE能通過增加線粒體膜電位和降低ROS水平改善細胞的線粒體功能損傷。袁風菊等[14]研究發現，EGB可通過調節Caspase-3減少心肌細胞的凋亡而發揮作用。GBE有保護線粒體功能，可能主要源于抗氧化作用，而GBE對肺纖維化中改善線粒體功能及調節Caspase-3需進一研究。通過探討GBE干預肺纖維化模型大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡的變化，結果顯示GBE干預組各時間點大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞（alveolar typeⅡ cell, AT-Ⅱ細胞）凋亡率低于模型組。說明GBE可能通過抑制AT-Ⅱ細胞的過度凋亡抑制肺纖維化[15]。在體外培養人胚肺成纖維細胞的研究中發現，GBE可通過干預肺FB的增殖與凋亡，起到減緩和阻斷肺纖維化發生、發展的作用，有利于肺纖維化恢復[16]。重度慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease, COPD）常合并肺纖維化改變。筆者的前期研究中，電鏡下發現GBE能改善COPD大鼠的肺間質纖維化進展[17]。

3 GBE通過調控細胞因子網絡發揮抗肺纖維化作用

3.1 轉化生長因子-β1

轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）主要分布在支氣管上皮細胞、巨噬細胞、增生的肺泡上皮細胞（Ⅱ型）及間質細胞，廣泛參與肺纖維化的發展，是肺纖維化形成和發展的關鍵性因子之一。其可觸發成纖維細胞向成肌細胞分化，促進成纖維細胞的遷移、增殖及向肌成纖維細胞轉化，促進細胞外基質的過度分泌，逐漸使纖維組織取代正常的肺組織，對肺功能造成不可逆的破壞[18-19]。TGF-β1能誘導肺泡上皮細胞-上皮間質轉化（epithelialmesenchymal transition, EMT），而EMT是肺纖維化的重要組成部分。此外，TGF-β1可以直接激活下游的促纖維化因子或者幾個信號級聯促進纖維化的發展，比如結締組織生長因子（connective tissue growth factor, CTGF）或者TGF-β/Smad信號通路等[2，20]。丁明橋等[21]在探討GBE對肺纖維化大鼠模型血清PDGF及TGF-β1影響的研究中發現，GBE能有效降低血清中血小板源性生長因子（platelet derived growth factor, PDGF）和TGF-β1水平，說明降低PDGF和TGF-β1等細胞因子水平可能是GBE防治肺纖維化的機制之一。潘勇軍等[22]的研究結果顯示，糖皮質激素聯合GBE治療后，肺纖維化患者血清TGF-β1降低，治療可阻斷肺纖維化進程。有文獻稱GBE可通過抑制纖維化早期肺泡巨噬細胞中TGF-β1的表達和增殖期非炎癥細胞中TGF-β1的表達，抑制大鼠肺損傷和纖維化[23]。GBE可通過調控TGF-β1抑制肺纖維化的發展。

3.2 腫瘤壞死因子-α

腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）主要由巨噬細胞產生，能夠誘導成纖維細胞的分化和增殖，刺激膠原蛋白合成，促進細胞外基質沉積，從而加速肺纖維化進程[24]。纖維化的病理標志是間質性肺炎，慢性炎癥被證實是肺纖維化發展過程中的重要因素。當肺組織發生炎癥刺激時巨噬細胞釋放TNF-α，TNF-α促使氧化物陰離子增加、促進中性粒細胞等炎癥細胞黏附而加重炎癥反應。多個研究表明，TNF-α不僅有促炎屬性，而且具有促纖維化等特征[25]。TNF-α在肺纖維化中起重要作用。有研究發現，TNF-α還可促進白細胞介素-2（Interleukin-2, IL-2）、IL-6等因子生成，IL-6不僅可調節炎癥反應，而且可引起B細胞前體轉化，并抑制纖維母細胞的凋亡[26]。邢彬等[27]的研究發現，GBE聯合潑尼松可更好地抑制TNF-α及IL-10的表達從而減緩肺纖維化的進展。GBE在早期肺泡炎階段可抑制TNF-α、IL-6的表達，在肺纖維化進展中GBE的抑制效果優于強的松[28]。因此，GBE可通過抑制TNF-α、IL-6的表達延緩肺纖維進展。

3.3 其他細胞因子

其他細胞因子可能單獨或者與其他細胞因子聯合影響肺纖維化發展，如CTGF是一種重要的致纖維化因子。CTGF可直接調節成纖維細胞活性，刺激成纖維細胞增殖和分泌膠原，聯合其他細胞因子促進成纖維細胞變成肌成纖維細胞及膠原合成，最終導致纖維化。多項實驗表明，CFGF的表達水平與纖維化嚴重程度呈正相關[29]。核轉錄因子-κB（nuclear factorκB, NF-κB）是一種重要的轉錄因子，在炎癥、細胞凋亡和分化過程中起重要作用。其可激活TGF-β的表達，促進成纖維細胞中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達，介導肺纖維化。實驗表明，使用抑制NF-κB表達的藥物，可抑制器官纖維化的進展[30]。血小板衍化生長因子是由血小板前體細胞產生的多肽生長因子，可促進淋巴細胞因子和炎癥因子釋放，加重炎癥反應和細胞增殖，參與促進成纖維細胞增殖、成纖維細胞產生膠原，影響細胞外基質代謝，從而參與肺纖維化形 成[31]。研究表明，GBE可抑制肺纖維化模型肺組織中的CTGF、PDGF高表達，從而抑制肺纖維化[32，21]；GBE可通過多種途徑抑制NF-κB的表達，從而減少細胞凋亡、內皮損傷和炎癥反應。因此推測，GBE可通過減少NF-κB的表達抑制肺纖維化發展[33]。

4 GBE通過調控基質金屬蛋白酶-9/金屬蛋白酶組織抑制劑-1系統平衡發揮抗肺纖維化作用

基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）是基質金屬蛋白酶家族的重要一員，正常肺組織中含量較少，肺纖維化患者中MMP-9基因表達升高。MMP-9可降解細胞外基質，改變細胞外基質成分與間質膠原的比例，導致肺損傷進而啟動肺纖維。早期肺纖維化中MMP-9可為成纖維細胞、炎癥細胞移行觸發肺纖維化創造條件。MMP-9通過多種途徑參與肺纖維化的發病過程。基質金屬蛋白酶組織抑制劑（tssue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs）是由成纖維細胞、內皮細胞等產生的多功能分子，TIMPs反映氣道的修復過程，是氣道纖維化的標志。TIMPs可促進成纖維細胞增生及膠原合成，使細胞外基質沉積并抑制其降解。研究發現，金屬蛋白酶組織抑制劑-1（tissue inhibitors of metalloproteinase-1, TIMP-1）在纖維化過程中呈較高水平并持續上升；且TIMP-1是MMP-9的天然抑制劑，能抑制MMPs活性，造成細胞外基質沉積。在肺纖維化發展過程中，肺組織早期以炎癥損傷為主，MMP-9表達增多，MMP-9/TIMP-1比值偏高；而TIMP-1在整個肺組織損傷過程持續增多，后期MMP-9表達減少。TIMP-1抑制MMP-9對細胞外基質的降解，導致MMPs/TIMPs比例失衡，促進肺纖維化發展。MMPs/TIMPs平衡在肺纖維化發展過程中發揮重要作用[34]。因此，通過平衡MMPs/TIMPs比例可能抑制肺纖維化發展。有實驗表明，通過GBE治療后，大鼠肺組織中MMP-9和TIMP-1的陽性細胞表達率下降，GBE能調節MMP-9/TIMP-1系統，使之趨于平衡，從而延緩或抑制肺纖維化的發生[35]。

肺纖維化的發病機制并不明確，但肺纖維化發病呈持續上升趨勢，且目前無安全有效的治療方法。因此，尋找高效且不良反應少的藥物，對于肺纖維化患者提高生活質量及生存率具有重要意義。銀杏葉作為我國傳統中藥用于治療肺部疾病已有多年歷史，GBE在肺纖維化的防治中有重要意義。GBE作為中藥有效成分安全性高且價格低廉，對于防治肺纖維化有良好的應用前景。目前，GBE用于治療肺纖維化的臨床報道較少，且不能完全解釋GBE治療肺纖維化的作用機制。因此，需要加大科研力度及開展更多的臨床研究證明GBE對肺纖維化治療的作用，這將為肺纖維化患者帶來新的希望。