外周血cfDNA及其在臨床轉化中的方法學研究進展

劉杰 劉冬 郭鵬 (北華大學，吉林 吉林 303；北華大學附屬醫院腎病風濕病科)

外周血循環游離DNA(cfDNA)的檢測作為一種無創、低耗、高效的液體活檢手段，憑借其得天獨厚的優勢，將逐漸成為未來精準醫學、個體化醫療發展過程中不可或缺的組成部分。近年來，隨著分子生物學檢測技術的日新月異，關于腫瘤患者cfDNA檢測的臨床研究逐漸增多，并已獲得了許多令人欣喜的成果。但介于研究中不同的標本采集、預處理、儲存方式及多樣化的檢測方法，不同的研究所得檢測結果往往差異顯著。因此，這種液體活檢手段遲遲未能應用于臨床。未來，建立一套從標本采集到cfDNA分離、檢測等一系列可用于臨床推廣的標準化檢測流程將成為該領域轉化醫學研究的核心內容。本文將對cfDNA的來源機制及目前各類臨床研究中外周血cfDNA的分離和檢測方法作一綜述。

1 外周血cfDNA

外周血cfDNA是一種無細胞狀態的胞外DNA，1948年Mandel〔1〕首次在健康人外周血中發現了這種游離DNA的存在。1977年Leon等〔2〕進一步發現腫瘤患者cfDNA水平明顯高于健康人群。10年后，Stroun等〔3，4〕進一步發現某些腫瘤源性的cfDNA具有與原發腫瘤高度相似的遺傳變異。1994年Vasioukhin等〔5，6〕進一步證實了上述說法，分別在急性髓系白血病、淋巴瘤、骨髓增生異常綜合征及胰腺癌患者的外周血游離DNA中檢測到與上述原發疾病相同的RAS基因突變。近20年來，已經有越來越多的研究〔7～12〕證實了癌癥患者外周血cfDNA與腫瘤組織遺傳變異的高度一致性，這些遺傳變異包括癌基因、抑癌基因的突變〔11〕，微衛星不穩定性〔13〕及DNA甲基化〔14〕等等。由此，外周血cfDNA的檢測作為一種新型“液體活檢”手段已成為近年來腫瘤轉化醫學中的研究熱點〔15，16〕。

2 外周血cfDNA機制

2.1外周血cfDNA來源 目前為止，鮮有研究數據可以直接詮釋DNA被釋放入血的具體過程及途徑。公認的外周血cfDNA來源的主要途徑為細胞的凋亡與壞死。

2.1.1健康人群外周血cfDNA來源 正常健康人體內由于存在自身的平衡機制使其血中游離DNA維持在一個較低水平，一般波動于0～100 ng/ml之間，均值30 ng/ml左右。這些微量目的DNA片段幾乎均來自于凋亡或壞死的細胞，包括細胞核及線粒體DNA的釋放，而與細胞核DNA相比，線粒體DNA可能對氧化損傷更為敏感〔17〕。此外，也有研究〔18〕稱健康人體內所有的活細胞都自發性向血液中釋放DNA片段，并稱其為代謝性DNA片段。

2.1.2腫瘤患者外周血cfDNA來源 與健康人群相比，腫瘤患者外周血cfDNA水平明顯增高。那么為何腫瘤患者外周血cfDNA水平與健康人群存在如此巨大的差異呢？有文獻〔19〕稱腫瘤患者增加的游離DNA可能同時來自于腫瘤細胞及其鄰近的非腫瘤細胞，且隨著腫瘤體積的增加，腫瘤患者體內凋亡及壞死細胞數目也隨之增長，這些過度凋亡及壞死的細胞超出了巨噬細胞的清除能力，進而不可避免的導致大量細胞碎片釋放入血。結合目前的研究〔20〕來看，腫瘤患者外周血cfDNA的來源機制較為復雜，且結論尚不一致，有如下幾種觀點。首先，與健康人群類似，細胞凋亡仍被公認是腫瘤患者DNA釋放入血的主要驅動因素之一〔21，22〕，凋亡細胞經巨噬細胞吞噬后，其內DNA可釋放入血成為cfDNA中的一員。有研究〔23〕對血漿標本進行的可視化凝膠電泳中，發現外周血中cfDNA片段的大小呈階梯樣均勻分布在180～1 000 bp，這與凋亡細胞的電泳條帶高度類似。其次，也有研究〔24〕發現細胞凋亡后在原位就會被巨噬細胞迅速吞噬，而并不會引起游離DNA水平的明顯變化，因此推測腫瘤細胞的壞死可能是外周血游離DNA的主要來源。但是，此種觀點目前存在的爭議較大，早前的體外實驗中，研究者們發現巨噬細胞在吞噬壞死腫瘤細胞過程中可被激活或死亡，這將導致細胞的核酸片段被釋放入血。而后，Cheng等〔25〕又動態監測了惡性腫瘤放療患者外周血cfDNA水平，發現放療后的2 w內患者cfDNA水平明顯上升，之后又迅速降低，這也力證了上述觀點。Sikora等〔26〕的研究指出，在胰腺導管腺癌、胰腺內分泌腫瘤及慢性胰腺炎的患者血漿中也幾乎均檢測不到可能來源于壞死細胞的更大片段的cfDNA。

3 外周血cfDNA的提取及提取前準備

3.1外周血cfDNA提取前血樣標本的采集、預處理與儲存 外周血cfDNA檢測手段遲遲未能于臨床推廣的最主要原因之一就是目前多數研究所得的檢測結果均存在差異，而這種差異常常被認為來源于不同的患者因素或檢測手段的靈敏性，卻很少有人注意到樣本采集、預處理及外周血DNA提取前樣本的儲存條件等因素對待檢血樣中cfDNA水平及片段大小等造成的巨大影響〔27，28〕。因此，建立一套DNA提取前血樣采集、預處理及儲存條件等標準化的前檢測程序是目前cfDNA檢測臨床轉化研究中亟待解決的問題之一。

3.1.1血樣標本的采集 關于cfDNA檢測中血樣標本的選擇，目前的研究結論較為一致。早期已經有大量研究〔28～30〕對血漿及血清中cfDNA的水平進行了比較，并且發現血清中cfDNA水平遠高于血漿，約為血漿的3～24倍。然而，研究〔28，30〕發現血清中cfDNA水平的增高是由于血液凝集過程中血細胞破裂后其內核酸物質釋放入血所致，這與患者血中實際的cfDNA水平并不相符。因此，毫無疑問血漿是目前所公認的外周血cfDNA的最優檢測標本。

3.1.2血樣標本儲存條件

3.1.2.1預處理前 血樣標本采集后的儲存時間及溫度是目前被認為與cfDNA水平變化密切相關的兩個控制因素。早期的多數研究〔28，31～33〕就已經發現隨著預處理前標本儲存時間的延長，其內cfDNA水平會隨之增高，但儲存溫度則對其影響甚微。有文獻〔27〕稱血樣標本在離心預處理前于室溫或4℃條件下儲存，6 h內其cfDNA水平不會產生明顯變化。但多數文獻〔28，31～39〕對血樣標本中cfDNA水平開始變化的時限說法不一。

那么，血樣標本中cfDNA水平變化的原因何在呢？首先，隨著儲存時間的延長，采血管中壞死和凋亡的血細胞數目逐漸增加，其破裂后將核酸物質釋放入血。其次，有文獻〔35〕稱血樣采集過程中對采血管的過度搖勻可使標本溶血，從而導致其內血細胞破壞，促使核酸物質被釋放。此外，還有研究〔40〕認為部分cfDNA可結合于細胞表面，隨著儲存時間的延長，這部分cfDNA逐漸與細胞分離進而導致cfDNA水平的變化。因此，外周血cfDNA的檢測標本在采集過程中應避免過度搖晃采血管而造成標本溶血，采集后的標本應盡早進行離心預處理以降低其被基因組DNA污染的可能性。而目前文獻關于上述因素對cfDNA片段完整性影響的報道甚少，僅個別研究〔27〕認為長時間儲存及血樣采集過程中對標本的過度搖晃可導致cfDNA片段完整性的降低。

3.1.2.2預處理后 首先，與離心前的血樣標本類似，標本的儲存時間及溫度仍是影響cfDNA水平的兩個重要因素，但目前有關此方面的文獻及研究較少，結論較為多樣化。Chan等〔28〕的研究中提到離心后的血漿標本在-80℃條件下儲存2 w，其內cfDNA水平無明顯變化。而Holdenrieder等〔41〕對離心后血清標本中cfDNA水平的變化進行了分析，發現在4℃或25℃條件下血清標本可穩定保存144 h，但于37℃下保存6 h后，其內cfDNA水平即出現了顯著下降。盡管該研究中應用了并不具代表性及說服力的血清標本，但至少可以證明離心后血樣標本中cfDNA對37℃更為敏感。其后也有文獻〔27〕稱離心后血漿標本在室溫下保存0～4 h，其內cfDNA水平會輕度增高，但這一現象可能與外周血中以其他方式(如：外泌體，微泡及核酸蛋白復合體等)存在的cfDNA被釋放入血有關。而通過對比分別儲存在-80℃，-20℃，4℃及室溫條件下3 h的離心后血漿樣本，研究者們還發現與其他3種儲存溫度相比，室溫可能會造成血樣標本中部分cfDNA的流失。其次，反復凍融則可能會導致cfDNA完整性的降低。有研究〔28〕稱血樣標本在反復凍融3次以上即可導致cfDNA的片段化，這一現象同時說明了cfDNA對溫度變化極為敏感。隨后El Messaoudi等〔27〕證實了上述說法，并建議如果不能及時對離心后的血漿標本進行cfDNA的抽提，則可將標本保存至-20℃或-80℃；如果可以即刻進行cfDNA的提取，標本可保存于4℃，但至多不要超過3 h；而凍融次數則最多不超過3次。此外，關于離心后樣本長期儲存對血樣中cfDNA水平的影響各研究結論不一，Sozzi等〔42〕稱在-80℃或-20℃條件下儲存的血樣，其cfDNA的損耗每年可達總量的30%。隨著標本儲存時間的延長，其內cfDNA每月可降低0.66 GE/ml。而2013年的一篇文獻〔27〕中則提到，血漿標本在-80℃下儲存，其內cfDNA水平至少可在9個月內保持穩定。然而，值得注意的是，盡管標本的長期儲存對cfDNA水平影響巨大，但只要檢測手段的靈敏度足夠高，其水平變化將不會影響檢測結果。最近，Page等〔39〕就在長達12年儲存于-80℃條件下的血漿標本中分離出cfDNA并成功地進行了單核苷酸多態性(SNP)檢測。

3.1.3血樣標本預處理 血漿標本的離心是血樣標本預處理的關鍵步驟，反復離心可除去血樣中殘存的白細胞及其破裂而釋放的DNA，從而獲得血中較為真實的cfDNA水平，這種反復離心不僅可在初次處理標本時連續進行，對于已經離心并凍存于-20℃的血樣仍可進行二次離心處理。然而，高速離心毫無疑問將導致血細胞的大量破壞，那么這些破裂血細胞所釋放的DNA是否會影響cfDNA的水平呢？目前有研究〔39〕對比了經不同速度及次數離心后血樣中的cfDNA水平，發現這二者間并無顯著差異，而其具體機制目前尚無人闡明。

4 外周血cfDNA的提取

傳統組織DNA常用的提取方法包括酚氯仿法、硅膠柱離心法及磁珠法等等。雖然，這些方法既往在組織DNA提取的相關研究中表現出色，但由于受到有害試劑、操作不便及對于DNA片段大小的特殊要求等因素的制約，導致了它們在血漿cfDNA提取過程中較高的相對丟失率、抑制率和較低的相對提取率。而有研究〔43〕稱，能夠影響外周血cfDNA提取物產量的獨立因素包括提取方法、定量檢測中靶基因的設定及實驗地點的選擇，毫無疑問提取方法是影響外周血cfDNA提取物產量最主要的因素。因而，近年來出現許多新興的外周血cfDNA提取方法，目前應用最為廣泛的包括Triton/Heat/Phenol Protocol(THP)及改良并集中上述不同提取原理而成的多種商業化試劑盒。

4.1THP THP提取方法中因涉及Triton-X100洗脫試劑及加熱、離心等操作而得名，該方法一般要求血漿樣本在DNA分離前于室溫(18～22℃)下儲存，且儲存時間小于2 h。這種方法由于無有害反應試劑，對后續PCR反應抑制小，提取物純度高及高效、低耗等優點逐漸取代了既往傳統的DNA提取方法，在外周血cfDNA提取的相關研究中被廣泛應用〔38〕。

4.2商業化試劑盒 此外，目前國內外市場中商業化試劑盒種類繁多，其中以QIAamp?、NucleoSpin?、Norgen?、FitAmp?等為主要代表，其中前兩種試劑盒在各類研究中表現均較為出色。QIAamp?試劑盒主要應用于純化基因組、線粒體、細菌DNA及總RNA和病毒核酸，由于試劑盒中存在特殊的核酸純化柱、96孔微孔反應板及污物硅膠吸附膜等裝置，從而避免了有毒操作并完全去除了二價陽離子、蛋白等聚合酶鏈式反應(PCR)反應抑制物，再經過緩沖液洗脫后即可得到高度純化的DNA產物〔44〕。而NucleoSpin?的同樣可獲得高純度的提取物并且在小片段DNA的提取中具有較高的提取率〔44〕。

4.3外周血cfDNA提取的方法學比較 目前有研究在各類商業化試劑盒之間及試劑盒與傳統提取方法間進行了外周血cfDNA提取效率的對比。但由于研究中樣本例數一般較少及受實驗室條件等多種因素限制，大多研究結論并不相同，各類文獻對此說法不一。目前大多數研究對商業化試劑盒的提取效率給予了肯定。Mauger等〔45〕對比了5種商業化試劑盒及苯酚氯仿(PC)，麥格納純緊湊型(MPC)，THP等傳統提取方法間外周血cfDNA的提取效率，發現這些商業化劑盒的整體提取效率幾乎均高于傳統方法，其中QIAamp?、Norgen?兩種試劑盒的優勢較為顯著，而Norgen?所獲DNA產物更多，樣本需求少，重復性更好。Devonshire等〔46〕則發現在QIAamp?、NucleoSpin?及FitAmp?的4種試劑盒中，QIAamp?CNA (circulating nucleic acid)試劑盒和NucleoSpin?NS(Plasma XS)試劑盒更加適合小片段DNA的提取，且均能獲得數量可觀的DNA產物。Page等〔39〕的研究中也稱與其他試劑盒相比，QIAamp?CNA試劑盒在小片段DNA提取中更有優勢。但有研究〔47〕稱高產量的DNA提取物中含有的PCR反應抑制劑(如血液防腐劑等)可能更多，那么這是否會對后續PCR反應產生抑制作用呢？為了解釋這個問題，Devonshire等〔46〕再次對上述兩種試劑盒所提取的DNA產物進行了探針及染料PCR反應，發現隨著每微升DNA提取產物對血漿樣本需求量的增加，NucleoSpin?NS試劑盒對PCR反應的抑制作用基本無變化；而QIAamp?CNA試劑盒在每微升DNA提取產物對血漿樣本需求量達125 μl時，其對后續探針PCR反應的抑制作用開始增強，當樣本需求量達250ul時，其抑制作用基本達峰值。其次，也有研究〔38，48〕稱MPC及THP等傳統方法比試劑盒的提取效率更好，但目前應用上述兩種方法的研究較少，因此該結論可能并不具有代表性。

綜上所述，外周血cfDNA的來源途徑及存在方式等機制目前已基本明確，其作為新興的“腫瘤液體活檢”手段將在未來最大化的實現惡性腫瘤的精準醫學及個體化治療。然而，目前多數外周血cfDNA的檢測仍停留在實驗研究階段，總結目前研究中外周血cfDNA提取前的樣本采集、預處理、儲存等操作流程對后續檢測結果的影響及甄選最優的提取方法將推動未來腫瘤轉化醫學的發展及外周血cfDNA標準化臨床檢測流程的建立。