通瘀煎對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成的影響及機制

盧素宏 姚麗梅 劉瑤 楊雅琴 林華景

(廣東食品藥品職業學院，廣東 廣州 510520)

動脈粥樣硬化(AS)指動脈管壁及其分支管壁內膜和內膜下出現脂質、碳水化合物及血液成分的灶狀沉積，結締組織和鈣沉積所致，同時出現大量中層平滑肌細胞向內膜移動、增殖，導致內膜增厚，逐漸形成粥樣病灶或纖維脂質斑塊病灶的一種炎癥性疾病，炎癥反應貫穿于AS發生發展的全過程。研究表明，AS是一種炎癥反應性疾病，炎癥反應貫穿于AS發生和發展的全過程〔1〕，動脈管壁內大量炎癥因子的形成和釋放與AS斑塊的形成關系密切〔2〕。在AS早期，當不穩定斑塊出現破裂時，即伴隨炎癥信號通路的激活。因此，及早識別不穩定的AS斑塊，探尋敏感而特異的血清學標志物及相關炎癥靶點，通過采用調節脂質代謝紊亂、抗炎等治療，減少或阻止AS等血管事件的發生是現階段研究的熱點之一。目前，防治AS的藥物研究相對較少，臨床常用他汀類藥物，其對AS的防治有一定的作用，但長期服用易導致肝損害等不良反應的發生〔3～5〕。中藥和中藥復方具有整體調節，適應證廣泛，毒副作用小等優點，在AS的預防和治療上具有自身獨到的特點。通瘀煎(《景岳全書》)具有活血祛瘀，行氣止痛的功效，臨床主要用于氣滯血積，經脈不利，痛極拒按等癥。研究表明，通瘀煎具有治療高脂血癥、改善血液流變學、抗炎等多種藥理活性〔6〕，提示其可能通過改善脂質代謝紊亂及脂質沉積、改善血液流變學等作用對血管壁起到較好的保護作用。本研究擬探討通瘀煎的抗AS作用及其作用機制。

1 材料及方法

1.1實驗動物 8周齡健康雄性SPF級載脂蛋白(Apo)E基因敲除小鼠50只，體重(25.0±2.0)g，購自北京微通利華實驗動物技術有限公司〔許可證號SCXK(京)2012-0001〕；8周齡SPF級雄性C57BL/6雄性小鼠10只，體重(20.0±2.0)g，購自廣東省動物實驗中心〔許可證號SCXK(粵)2015-0109〕。

1.2通瘀煎藥材組方 當歸尾15.0 g，山楂6.0 g，香附6.0 g，紅花6.0 g，烏藥6.0 g，青皮4.5 g，澤瀉4.5 g，木香2.1 g，均購自康美藥業。阿托伐他汀鈣片(立普妥，規格：20 mg×7片)購自輝瑞制藥有限公司；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)購自上海博湖生物科技有限公司。高脂飼料(3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油、81.3%基礎飼料均勻混合而成，以鈷60輻照-輻照劑量25.0 kGy)由廣東省實驗動物中心加工。

1.3儀器及試劑 LBY-N6B型全自動模塊式血液流變儀；生物組織包埋機(TB-718D型)；智能程控生物組織自動脫水機(TC-120S型)；Zeiss-Axioskop20顯微鏡電子顯微鏡、透射電鏡；E-選擇素(E-selectin)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、血管細胞黏附分子(ICAM)-1 ELISA試劑盒、血管內皮細胞黏附分子(VCAM)-1 ELISA試劑盒、白細胞介素(IL)-6 ELISA試劑盒、干擾素(IFN)-γ ELISA試劑盒均購自上海拜力生物科技有限公司。抗-細胞因子信號轉導抑制蛋白(SOCS)1單抗、抗-細胞內信號傳導及轉錄活化子(STAT)3單抗、抗-phospho-STAT3(Tyr701)單抗均購自廣州浩瑪生物科技有限公司。

1.4動物分組及給藥 采用隨機數字表法，50只ApoE基因敲除小鼠隨機分為5組各10只，模型組、陽性藥物組(立普妥組)、通瘀煎低、中、高劑量組均以高脂飼料飼養；C57BL/6雄性小鼠10只為空白組，以普通飼料喂養。實驗第1天起，通瘀煎高、中、低劑量組分別給予通瘀煎26.0、13.0、6.5 g/(kg·d)灌胃給藥；立普妥組給予立普妥5 mg/(kg·d)灌胃給藥(藥物均用0.5% CMC-Na配成混懸溶液后給藥)，空白組、模型組給予等量0.5% CMC-Na灌胃，均持續給藥12 w。通瘀煎常規中藥煎煮，經減壓旋轉濃縮成每毫升相當于1 g生藥的混懸液。

1.5指標檢測 ①小鼠主動脈石蠟冰凍切片，以蘇木素-伊紅(HE)染色，Zeiss-Axioskop20顯微鏡下觀察主動脈管壁形態學變化情況。②AxiocanHRc相機拍攝主動脈HE染色切片，用Leica Qwin Image Processing and Analysis軟件分析切片上顯示的AS和血管橫截面管腔面積。③主動脈超薄切片，采用JEM-1200EX型透射電鏡觀察管壁超微結構變化。④血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量的測定； ⑤ELISA檢測血液中黏附分子E-selectin、ICAM-1、VCAM-1的含量及主動脈組織內IL-6、IFN-γ、腫瘤壞死因子(TNF)-α的含量； ⑥Western印跡法分析主動脈STAT3、磷酸化(p)STAT3、SOCS1蛋白表達水平。

1.6統計學方法 采用SPSS16.0軟件進行正態性檢驗、單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組主動脈組織形態學 空白組主動脈形態規則完整，內膜光滑，沒有出現局部缺損或增厚，內彈力層連續規整、無斷裂現象，平滑肌細胞呈整齊有序排列，未見炎性細胞浸潤，管腔內無贅生物形成。模型組主動脈形態結構出現明顯改變，內膜明顯增生、增厚，連續性結構破壞，大量泡沫細胞積聚在管腔內、大量膽固醇結晶堆積，內膜增生處明顯的缺損及間斷性鈣化灶和無結構樣壞死物，明顯的AS斑塊纖維帽；中膜亦出現增厚、變形，內膜層可見大量的平滑肌細胞堆聚。與模型組比較，各給藥組主動脈根部粥樣斑塊的形成明顯受到抑制，病變程度明顯減輕，其中通瘀煎低劑量組主動脈根部斑塊內的脂質中心面積相對變小，斷續性鈣化灶和無結構樣壞死物；通瘀煎高劑量組AS病變程度最輕，僅少量鈣化灶和無結構樣壞死物。見圖1。

圖1 各組主動脈組織病理(HE染色,×200)

2.2各組主動脈粥樣硬化病變相對面積 與空白組〔(0.76±0.11)%〕相比，模型組主動脈病變相對面積〔(26.37±4.59)%〕顯著增加(P<0.01)。與模型組相比，立普妥組〔(9.51±1.68)%〕、通瘀煎低、中、高劑量組主動脈病變相對面積〔(13.68±2.27)%,(12.87±2.55)%,(9.83±1.81)%〕均有明顯減少(P<0.01,P<0.05)。與通瘀煎中、低劑量組相比，立普妥組及通瘀煎高劑量組主動脈病變相對面積較少(P<0.05)。

2.3主動脈電鏡觀察 空白組主動脈內皮細胞排列整齊、形態正常，細胞核完整，內彈力膜連續完整無缺損、厚薄均勻，未發現脂質空泡形成及膠原纖維增生。模型組主動脈出現一定程度的病理改變，內皮細胞出現大量脫落、壞死，壞死處的內皮細胞基本消失，出現大量細胞碎片及纖維樣物質，大量脂質沉積于內皮下方，間質內亦可見大量膠原纖維附著，內彈力膜出現連續性破壞，部分區域有灶性溶解，大量泡沫細胞浸潤，膠原纖維顯著增多。與模型組比較，各給藥組主動脈超微結構病理改變均有不同程度減輕，其中通瘀煎低濃度組主動脈內皮細胞出現少部分脫離，有少量壞死內皮細胞，彈力膜呈間斷性破壞，局部可見溶解，散在性脂滴浸潤于內皮下層，有少量泡沫細胞堆積及膠原纖維增生出現在中膜內；通瘀煎高劑量組內彈力膜結構基本完整，AS超微結構改變最少，內皮下僅觀察到少許膠原纖維沉積及脂質空泡浸潤。見圖2。

圖2 各組主動脈超微結構(透射電鏡，×12 500)

2.4各組血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量比較 與空白組相比，模型組TC、TG及LDL-C顯著升高、HDL-C顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，立普妥組與通瘀煎中、高劑量組TC、TG及LDL-C含量明顯降低，HDL-C含量明顯升高(P<0.05,P<0.01)。與模型組相比，通瘀煎低劑量組血脂改善并不明顯(P>0.05)，但有下降的趨勢。與通瘀煎中、低劑量組相比，立普妥組和通瘀煎高劑量組TC、TG及LDL-C含量明顯降低，HDL-C含量明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量比較

與空白組比較：1)P<0.01;與模型組比較：2)P<0.01，3)P<0.05;與通瘀煎中、低劑量組比較：4)P<0.05；表2、3同

2.5各組血清黏附分子含量比較 與空白組相比，模型組血清E-selectin、ICAM-1、VCAM-1含量顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，立普妥組、通瘀煎中、高劑量組血清E-selectin、ICAM-1、VCAM-1含量明顯降低(P<0.01,P<0.05)，通瘀煎低劑量組E-selectin含量顯著降低(P<0.05)，VCAM-1、ICAM-1有下降趨勢，但無統計學差異(P>0.05)。通瘀煎中、低劑量組ICAM-1、VCAM-1顯著高于立普妥組和通瘀煎高劑量組(P<0.05)，見表2。

2.6各組主動脈內炎癥因子的含量比較 與空白組相比，模型組主動脈組織IL-6、IFN-γ、TNF-α含量顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，立普妥組與通瘀煎高劑量組主動脈組織IL-6、IFN-γ、TNF-α含量明顯降低(P<0.01)。通瘀煎中、低劑量組主動脈組織IL-6、TNF-α含量顯著低于模型組且高于立普妥組和通瘀煎高組(P<0.05,P<0.01)。見表3。

2.7各組主動脈STAT3、p-STAT3、SOCS1蛋白表達比較 與空白組相比，模型組主動脈組織STAT3、SOCS1含量顯著降低(P<0.01)，p-STAT3顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，立普妥組、通瘀煎高、中劑量組主動脈組織STAT3、SOCS1含量明顯增高(P<0.05,P<0.01)，p-STAT3含量明顯降低(P<0.01)，通瘀煎低劑量組主動脈組織p-STAT3含量明顯降低(P<0.05)，SOCS1含量明顯增高(P<0.05)。通瘀煎高劑量組p-STAT3含量降低及SOCS1增高顯著優于各給藥組(P<0.05)。見表4。

表2 各組血清E-selectin、ICAM-1、VCAM-1含量比較

表3 各組主動脈內炎癥因子IL-6、IFN-γ、TNF-α含量比較

表4 各組主動脈組織STAT3信號通路相關蛋白表達水平比較

與空白組比較：1)P<0.01;與模型組比較：2)P<0.01，3)P<0.05;與通瘀煎中、低劑量組比較：4)P<0.05;與立普妥組比較：5)P<0.05

3 討 論

AS是臨床常見的一種血管病變，是現階段威脅人類健康最為嚴重的心血管疾病之一。目前，人類對AS的研究已經由最初單一的血脂變化逐漸發展到管壁細胞學、內皮功能紊亂、氧化應激、炎癥反應等多個方面。AS是一種炎癥性疾病，血管內、外的炎癥反應貫穿于AS發生發展的前過程。IL-6是炎癥反應瀑布的源頭所在，發揮著極為重要的介導作用，參與AS的形成和發展過程，與AS病變程度呈正相關。IL-6通過與其受體緊密結合后，可誘導STAT3得以活化，活化后的STAT3(p-STAT3)可參與激活多種基因表達。研究證實，IL-6/STAT3信號傳導通路在AS中可被激活〔7〕，IL-6為源頭所在，其過度表達可激活STAT3信號通路，從而表現出促AS作用〔8〕。事實上，這種慢性炎癥反應的發生，是由VCAM-1、ICAM-1和E-selectin等黏附分子所介導的。AS的形成過程中ICAM-1、VCAM-1、E-selectin等黏附分子介導的炎癥過程，在AS的發生發展全程中起著非常重要的作用，可明顯增強聚集反應，導致斑塊的形成，并影響粥樣斑塊的穩定性〔9，10〕。

本研究中AS小鼠血脂、黏附分子及炎癥因子的各項指標趨勢與主動脈組織病理學變化大致相符。可見，AS模型小鼠存在嚴重的脂質代謝紊亂、血清黏附分子及炎癥因子大量生成，這一結果也進一步驗證實了AS是一種炎癥反應，AS的過程伴隨有大量炎癥因子的釋放。本研究提示AS模型主動脈組織中STAT3被活化，主動脈組織及血液中IL-6、IFN-γ、TNF-α等炎癥因子大量表達。通過藥物干預后發現，通瘀煎可糾正或改善AS小鼠脂質代謝紊亂，減少血液中黏附分子E-selectin、VCAM-1、ICAM-1及主動脈組織中IL-6、IFN-γ、TNF-α等炎癥因子的含量，誘導SOCS1的蛋白含量表達，減少STAT3的磷酸化，從而抑制增生信號通路IL-6/STAT3的活化，從而顯著抑制或改善AS小鼠血液黏、凝、稠、聚的“血瘀”證狀態。因此認為，通瘀煎的抗AS作用可能通過抑制IL-6/STAT3信號通路，發揮其抗炎、抗增生效應，從而有效抑制AS斑塊的形成。

綜上，AS狀態下，主動脈組織中大量IL-6、IFN-γ、TNF-α等炎癥因子的生成，可刺激STAT3增生信號通路的激活，相關的基因及蛋白表達均呈現出高水平表達。通瘀煎低、中、高劑量均表現出一定的抗AS作用，以高劑量組效果最佳。其可能通過降脂、減少炎癥因子的釋放、抑制主動脈內炎癥及增生反應的發生，從而表現出較好的抗AS斑塊形成的作用。此外，在本實驗周期范圍內，低劑量的通瘀煎具有一定的抗AS作用，但其對AS小鼠并未呈現出明顯的降脂作用。因此推測，低劑量通瘀煎可能不在其降脂最小有效劑量范圍，其降脂效應在一定范圍內可能呈劑量依賴性。但通瘀煎低劑量組主動脈根組織病理形態改變明顯優于模型組，未發現有明顯粥樣斑塊的形成，提示通瘀煎可能有獨立于降脂之外的抗AS作用，這一作用可能是通過其良好的抗炎作用得以實現。