角質形成細胞在銀屑病中作用的研究進展①

黃海勇 黃功華 劉新光

(廣東省醫學分子診斷重點實驗室,廣東醫科大學衰老研究所，廣東醫科大學生物化學與分子生物學研究所,東莞 523808)

銀屑病是慢性易復發炎癥性皮膚病,可分為尋常型、斑點型、間質型、膿胞型、紅皮病型，臨床癥狀為界限清楚的紅色斑點、丘疹、皮膚褶皺、銀白色樣鱗屑，病理變化為角質形成細胞(keratinocyte,KC)高度異常增殖、角化不全、棘皮增厚、伴有炎癥細胞浸潤和血管增生，在世界范圍內的患病率大約為2%[1-3]。銀屑病由表皮和真皮中不同的效應白細胞亞群的浸潤引起，涉及固有性和適應性免疫過程。關于KC在銀屑病中的作用尚存爭議，研究認為KC的過度增殖和異常分化是免疫系統激活誘導的次要現象，主要基于免疫功能紊亂的樹突細胞(dendritic Cell,DC)和Th17細胞，而銀屑病不能被認為是單獨的DC和Th17細胞依賴性免疫疾病。健康的皮膚為機體提供有效的物理和免疫保護屏障，最先接觸病原體而快速感知環境信號變化，并對不同的刺激信號產生反應，維持皮膚生理功能的動態平衡。KC在銀屑病早期觸發致病事件及維持疾病慢性期方面起重要作用,在觸發因子(如皮膚創傷、病原體或藥物等)激活后打破皮膚生理穩態，產生細胞因子(包括抗菌肽、IL-1家族和趨化因子等)成為先天免疫介質來源，皮膚免疫微環境改變并通過募集DC、中性粒細胞、Th17細胞和巨噬細胞等引發適應性免疫[4]。KC和適應性免疫細胞的相互作用進一步加劇炎癥反應，并維持疾病慢性期。此外，由免疫細胞產生的細胞因子誘導的關鍵信號通路的激活和KC內在遺傳信息改變，可能是造成增殖和分化過程不平衡及在銀屑病皮膚中誘導炎癥反應的原因。目前銀屑病研究的模型主要包括自發性小鼠模型、基因動物模型、異體移植動物模型和人工誘導的動物模型[5]。盡管銀屑病既往的研究取得了重大進展，但具體發病機制尚不明確。研究KC在銀屑病的發病機制對臨床治療和預后、提高患者生活質量具有重大意義。

1 KC在銀屑病中的屏障功能

1.1磷脂酶C同工酶PLCδ1(phospholipase C isozymes δ1,PLCδ1)異常破壞KC屏障完整性 磷脂酶C(phospholipase C,PLC)是磷脂酰肌醇信號通路的關鍵酶，活化的PLC能水解磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(Phosphatidylinositol biphosphate,PIP2)產生重要的第二信使二脂酰甘油(diacylglycerol,DAG)和三磷酸肌醇(inositol triphosphate,IP3)。IP3是細胞質Ca2+濃度梯度的主要調節因子。PLC調節細胞活動的生理途徑，并調節和協調這些途徑中的其他酶作用，控制細胞生理學行為[6]。研究發現，在銀屑病的病損皮膚中PLC的同工酶活性PLCδ1下降[7]。在咪喹莫特(imiquimod,IMQ)誘導的銀屑病模型中，敲除PLCδ1不但可影響KC的屏障功能，并且可破壞KC之間的緊密連接。體外研究證明，抑制PLCδ1表達后，內質網Ca2+通道的Ca2+釋放不足導致細胞質內Ca2+濃度降低，Ca2+誘導的核轉錄因子(nuclear translocation of the transcription factor,NFAT)活化不足，使與屏障功能相關的下游基因轉錄表達水平下降。另外，PLCδ1被抑制后p38的磷酸化水平升高，從而抑制RhoA信號通路，在PLCδ1敲除的細胞中通過p38抑制劑抑制p38磷酸化活性，恢復絲聚蛋白(Filaggrin)和緊密連接蛋白1(zonula occludens-1 protein,ZO-1)水平。表明在銀屑病病損皮膚中，PLCδ1表達降低導致p38磷酸化水平升高可損傷KC屏障功能[8]。

1.2CARD14激活NF-κB信號通路影響KC屏障功能 半胱天冬酶募集結構域封閉蛋白質(caspase recruitment domain-containing protein,CARD)是氨基酸序列極度保守的細胞支架蛋白，發揮關鍵生物學功能，包括免疫應答和炎癥調節、組織穩態和G蛋白偶聯受體信號傳導的調節[9]。人CARD蛋白分別由位于7,17和22號染色體上3個保守基因編碼。CARD家族的表達具有組織差異性，CARD14主要在KC中表達。CARD14：BCL10：MALT1(CBM)復合物是維持固有免疫和適應性免疫應答的重要信號節點，主要通過識別上游病原體相關模式分子(如KC上表達的TLR家族成員)激活發揮效應，發揮在表皮屏障的固有免疫防御作用[10，11]。細胞接受刺激后，位于卷曲螺旋結構域(coiled-coil domain)和突觸前密度蛋白(post-synaptic density protein,PDZ)之間的抑制性接頭區域的CARD14通過蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)介導的絲氨酸殘基的磷酸化去除抑制，從而促進CBM復合物形成，最終導致IκB激酶復合物(IκB kinase complex ,IKK)的募集和NF-κB活化[12，13]。CARD14通過募集BCL10和MALT1促進NF-κB和MAPK信號通路激活，從而上調編碼IL-36γ、IL-8、CCL20和抗菌肽等促炎基因，刺激DC活化并分泌IL-23、IL-1β誘導naive T 細胞向Th17分化加劇炎癥反應[14]。小鼠CARD14基因中第138位谷氨酸突變后可引起自發性銀屑病，包括特征性的臨床表現和病理變化，皮膚出現類似于銀屑病的典型細胞因子、趨化因子和抗菌肽基因的上調及絲聚蛋白和連接蛋白表達下降[15]。因此，CARD14是銀屑病的易感基因并對銀屑病的預測和預后具有重要意義。

2 KC的增殖和分化

2.1視黃醇結合蛋白Ⅰ(cellular retinol binding protein Ⅰ,CRBPⅠ) 視黃醇(維生素A)及其代謝產物視黃醛和全反式維甲酸是細胞活動的天然調節劑，介導皮膚細胞調節功能[16]。視黃醇水溶性差，胞質內CRBPⅠ有助于細胞攝取視黃醇，保護視黃醇免受與酶的非特異性相互作用，將全反式維甲酸遞送至核受體(CRABP2，FABP5)，維持全反式視甲酸在細胞內的功能穩定，調節細胞凋亡、增殖和分化進程[17]。銀屑病患者的病損皮膚側CRBPⅠ異常升高，IMQ誘導的小鼠銀屑病模型中，CRBPⅠ基因敲除小鼠的發病程度比野生型小鼠更嚴重。在人表皮細胞中持續表達CRBPⅠ，維持細胞增殖NF-κB和AKT信號通路、顯著激活，與視黃醇在細胞內過度累積導致細胞功能異常相關。炎癥因子IL-2和IL-6誘導輔助性T細胞活化，并維持輔助性Th17細胞和調節性T細胞平衡，在人表皮細胞中過表達CRBPⅠ可明顯降低IL-2和IL-6水平[18]。病損皮膚中高表達的CRBPⅠ同樣能誘導早期生長反應基因1(early growth response gene 1，EGR1)表達[19]。KC中EGR1通過抑制細胞分裂周期基因25A(cell division cycle 25 A,CDC25A)表達和降低細胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinas 2,CDK2)上的Tyr15/Thr14去磷酸化水平減少CDK2 /細胞周期蛋白E復合物激活，使細胞周期停滯在G1期，這可能是銀屑病CRBPⅠ介導EGR1抑制細胞增殖的潛在機制[20]。

2.2Wnt5a/β-Catenin信號 Wnt5a參與KC增殖的整個過程，與正常皮膚相比，Wnt5a及其7 次跨膜蛋白卷曲受體Frizzled2/5在銀屑病病損皮膚中高表達。同時，凋亡相關蛋白Caspase-3降低而抗凋亡相關的Bcl-2、生存素相應升高。研究發現，Wnt5a可通過經典的Wnt/β-catenin途徑或非經典的PKC/鈣依賴性蛋白激酶Ⅱ途徑影響KC增殖凋亡，胞質中的β-catenin在GSK3β/Axin/APC蛋白復合物作用下無活性[21]。Wnt5a信號激活使復合物中的GSK3β磷酸化水平升高，對β-catenin的抑制能力下降，導致β-catenin轉位到細胞核調節下游Cyclin D1、C-myc活性，調節KC增殖。敲除Wnt5a可下調細胞增殖相關的標志如PCNA和KI67的水平。同時，病損皮膚中的IL-36γ借助Wnt/β-catenin信號抑制KC分化并誘發炎癥反應[22]。

2.3PI3K/AKT/mTOR信號通路 銀屑病患者中磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)水平升高，多種炎癥因子如IL-6、IL-12、CXCL8、VEGF可被mTOR信號通路激活分泌[23]。PI3K/AKT/mTOR信號通路是真核細胞的關鍵信號點，調節細胞生長、增殖和新陳代謝。銀屑病中，KC在細胞外信號作用下，PI3K在配體結合酪氨酸激酶受體或G蛋白偶聯受體后活化，PI3K與胞膜的PIP3協同作用并充當第二信使募集AKT和磷酸肌醇依賴性激酶(phosphoinositol-dependent-kinase 1,PDK1)到膜上，信號轉換后，mTORC1通過磷酸化真核起始因子4E結合蛋白 (eukaryotic translation initiation factor 4E binding proteins,4EBP)或核糖體S6蛋白激酶1/2(ribosomal S6 protein kinases,S6K1/2)，促進mRNA釋放并增加與翻譯起始因子的結合形成活化的翻譯起始復合物?；罨腟6K通過抑制真核延伸因子2激酶(eukaryotic elongation factor 2 kinase,eEF2K)活性，使蛋白翻譯延伸。mTORC1控制蛋白質生物合成速率、調節細胞生長和增殖必需的大分子合成[24]。KC中的mTOR信號通路被永久激活，使表皮呈現高度異常增殖和成熟分化功能被抑制銀屑病。高度活化的PI3K/AKT/mTORC1可抑制角質形成細胞的細胞核自噬功能，在角質形成細胞向成熟的角質細胞分化過程中，高mTORC1活性抑制核降解導致角化不全[25]。mTOR是雷帕霉素的靶蛋白，已有研究表明雷帕霉素在銀屑病中有抗增殖和免疫抑制作用，雷帕霉素處理IMQ誘導的銀屑病小鼠的皮膚明顯病情明顯改善，表明局部應用mTOR抑制劑可能成功治療銀屑病[26]。KC的增殖分化平衡在銀屑病的發生發展中扮演重要角色，諸多因素參與這一過程，尋找銀屑病中與KC更具特異性的相關信號通路，可為臨床治療提供理論依據。

3 銀屑病中KC與免疫細胞的相互作用

3.1銀屑病早期KC參與固有免疫反應 在銀屑病的初始階段，KC參與DC、中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞的募集和活化過程，早期KC在外界應激、創傷、感染、藥物的刺激下產生TGF-β1、IL-1、IL-6和抗菌肽SA100家族等炎癥因子,使未成熟的DC活化并誘導naive T 細胞向不同效應T細胞亞群分化。報道顯示，KC在受到外界刺激后，產生抗菌肽LL-37并與損傷細胞釋放的核酸形成復合物，誘導DC表達IFN-γ、IL-6和TNF-α[27]。KC的LL-37通過旁分泌和自分泌通路調節自身IL-1家族細胞因子表達(包括IL-36γ)[28]。此外，KC中LL-37通過IL-36R信號傳導誘導CXCL8和CXCL1等趨化因子表達，加速病損皮膚中中性粒細胞的募集。LL-37在銀屑病KC中誘導CXCL10和CCL20的表達，可能是DC和Th17在銀屑病后期固有性免疫的原因之一。

3.2銀屑病慢性期KC誘導適應性免疫 銀屑病中DC激活是驅動T細胞分化的決定因素，DC功能的成熟取決于早期先天免疫期期間由KC釋放的介質，其中IL-36、IL-1家族可影響DC功能，未成熟的DC在受到這些細胞因子的刺激下活化，并產生IL-12，促使naive T cell 向Th1分化，Th1分泌IFN-γ、TNF-α引發細胞免疫[29]。研究發現，活化的DC同樣可產生和IL-12具有共同亞基P40的IL-23，IL-23誘導naive T 細胞向Th17分化，Th17細胞分泌IL-17A、IL-17F、TNF-α、IL-22等。KC表面的IL-17受體IL-17R接受刺激信號后，表達多種趨化因子，包括CCL20、CCL1、CCL2、CCL3、CCL5、CCL8。CCL20可直接募集CCR6+細胞到病損皮膚，并提高β-防御素、S100A家族水平[30]。KC釋放的IL-18與IL-12協同作用，通過在銀屑病損傷皮膚中誘導IFN-γ而促發Th1應答[31]。γδT細胞浸潤可在IL-18存在下通過IL-23信號軸產生IL-17[32]。KC本身作為銀屑病發病的起始因素感受外界刺激，產生與正常皮膚不同的細胞因子和趨化因子。病損皮膚KC接受DC和Th17細胞的刺激信號并放大DC-Th17的病理效應，形成正反饋通路使KC增殖分化失去控制導致過度增生并分泌炎癥因子。作用于IL-17的藥物正處于Ⅲ期臨床試驗，包括IL-17A單克隆抗體Secukinumab、Ixekizumab和IL-17RA單克隆抗體Brodalumab，隨著研究的深入，更多藥物將被用于銀屑病臨床治療。

4 總結與展望

銀屑病的發生是多因素、多信號、多細胞參與的復雜調控過程。KC是炎癥反應始動者，與其他免疫細胞相互作用產生炎癥信號網絡通路影響自身增殖分化及皮膚局部炎癥反應。因此KC穩態被打破將誘發疾病。轉錄組學、病理學、分子生物學等方法使課題組對銀屑病中KC的作用機理有了更為深入了解。雖然部分針對KC作為銀屑病治療靶標的生物學方法已取得初步成效，但銀屑病中KC細胞的作用機制仍有待進一步研究，以期發現銀屑病更有效的治療方法。