比格犬慢性冬眠心肌模型的制備

高萬里，張鵬飛，常志揚，魏志潘，臧小彪，王現青，張靜，高傳玉，趙永輝

(河南大學人民醫院/華中阜外醫院 a.心血管內科;b.超聲科，河南 鄭州 450003)

冠狀動脈閉塞后，根據缺血的程度、速度、范圍以及是否存在側支循環，心肌細胞可能出現以下3種情況。(1)冬眠心?。河砷L期的血流低灌注狀態造成的靜息狀態下左心室功能持續低下，當冠狀動脈血流恢復正常灌注后，收縮功能可完全或部分恢復，是心肌細胞應對缺血損傷的保護性機制。(2)頓抑心肌：心肌急性缺血緩解后，心肌細胞并未壞死，當冠狀動脈供血恢復后，心肌收縮力和心肌代謝需要一定的時間才能恢復。冬眠心肌和頓抑心肌都具有收縮功能儲備，屬于存活心肌。(3)壞死心?。盒募〖毎寻l生不可恢復的損傷，當冠狀動脈恢復灌注后，心肌收縮力無法恢復，心功能亦不會改善。冬眠心肌由于恢復血供后可部分或完全恢復，具有重要的研究價值。

近年來，冬眠心肌成為了心血管領域的研究熱點[1]，但經濟且有效的冬眠心肌模型的制備方法尚未統一。查閱國內外文獻可見，目前較常用的方法是球囊擴張+內膜剝脫，造成冠狀動脈左前降支狹窄，亦有開胸后使用縮窄環造成慢性閉塞的模型[2-4]。但該研究方法缺乏準確的冠狀動脈的閉塞百分比，對實驗室及實驗人員條件要求高，實驗花費大，X線下對實驗者有輻射傷害，動物死亡率高。本研究采用開胸法暴露犬冠狀動脈左前降支中遠段，用游標卡尺測量冠狀動脈直徑，采用不同粗細鋼絲結扎，確保管腔狹窄程度在75%左右，以期為研究冬眠心肌提供簡單易行的模型制備方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康成年比格犬16只，月齡為12～36個月，體質量為(11.2±1.9)kg，雌雄各半。所有動物研究完全符合國家《實驗動物管理條例》。實驗動物由南京亞東實驗動物研究中心提供，編號：NO.201708679。將實驗動物按照隨機數表法分為A、B兩組，A組為冬眠心肌模型組，B組為假手術組，每組8只。A組月齡為(16.1±3.1)個月，體質量為(11.8±1.2)kg；B組月齡為(15.9±2.5)個月，體質量為(12.0±1.0)kg。兩組間體質量及月齡差異無統計學意義(均P>0.05)。

1.2 實驗方法A組30 g·L-1戊巴比妥鈉30 mg·kg-1靜脈注射麻醉后，氣管插管接麻醉呼吸機給予機械通氣，連接多功能監護儀。觸診心尖搏動最強點，胸骨左緣第四肋間標記理想搏動點，常規備皮，消毒，鋪巾，按標準外科程序開胸，打開心包，暴露冠狀動脈左前降支(left anterior descending，LAD)中遠段，無菌條件下使用游標卡尺測量靶血管直徑，用帶線縫合針(5-0)穿過靶血管下方心肌表面，繞過靶血管備結扎阻斷，使用不同粗細鋼絲將血管與鋼絲緊密結扎，而后迅速抽出鋼絲，確保結扎后造成靶血管70%～75%狹窄，觀察臨近靶血管供血區域血供情況，可見其心肌顏色較前稍有變淺。B組將絲線穿過前降支下方，但不結扎，其余同A組。術后連續3 d給予五水頭孢唑琳0.5 g肌內注射，每日3次，預防切口感染。1周后開始進行加強運動訓練，即實驗犬每日運動量不少于4 h。術后3個月終止實驗。

1.3 觀察指標

1.3.1A組小劑量多巴酚丁胺負荷超聲檢測 正式實驗前24～48 h，胸前壁備皮。用4.0 MHz電子相控陣扇擴探頭在胸骨右緣進行體外超聲掃查，取標準乳頭肌水平左室短軸切面，對比觀察左室前間壁(冬眠心肌)和后壁心肌(正常對照區)的收縮功能。采用M形取樣線通過左室前間壁和后壁測定基礎狀態下和不同劑量多巴酚丁胺(2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μg·kg-1·min-1，每期3 min)負荷時局部心肌的收縮功能。以收縮期室壁增厚率(wall thickening，WT%)表示心肌收縮功能。以靜脈輸液泵控制多巴酚丁胺劑量分別為2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μg·kg-1·min-1[5-6]。

1.3.2靜息時室壁運動分析 按照美國超聲協會左心室16節段劃分法，請兩位主治及以上職稱超聲科醫生以目測法觀察LAD供血區室壁運動情況[7]：1分為運動正常，2分為運動幅度減低，3分為運動消失，4分為矛盾運動，即收縮期心外膜向外膨出，室壁變薄。室壁運動計分指數(wall molion score index，WMSI)=各節段記分之和/總節段數。正常值為1。

1.3.3左心室整體收縮功能測定 選取左室長軸切面圖像，應用M型超聲心動圖連續測量3個不同心動周期的左室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)，取平均值，比較術前、術后左心室整體收縮功能。

2 結果

2.1 模型制備概況本實驗A組和B組共16只比格犬，均順利完成實驗，且A組造模成功，各項數據基本符合預期要求，無麻醉意外，無心肌梗死、感染等術后并發癥。

2.2 A組超聲心動圖多巴酚丁胺負荷試驗A組行超聲心動圖多巴酚丁胺負荷試驗時，左室前間壁(冬眠心肌區域)與左室后壁(正常心肌區域)進行比較。隨著多巴酚丁胺劑量增加，左室前間壁(冬眠心肌區域)收縮期WT%明顯降低，且出現雙向運動，即室壁運動隨多巴酚丁胺劑量增加，先出現室壁運動增強，而后室壁運動減弱(均P<0.01)。隨多巴酚丁胺劑量增加，左室后壁(正常心肌區域)室壁運動持續增強(均P<0.01)，冬眠心肌模型成功。見表1。A組小劑量多巴酚丁胺負荷左心室壁運動超聲影像見圖1。

表1 A組左室前間壁與左室后壁不同藥物劑量下的WT%比較

注：與左室前間壁基礎狀態比較，aP<0.01；與左室后壁基礎狀態比較，bP<0.01。

A—多巴酚丁胺泵速為15 μg·kg-1·min-1；B—多巴酚丁胺泵速為20 μg·kg-1·min-1，室壁運動減弱，室壁厚度變??；D1—左室前間壁厚度；D2—左室后壁厚度。

圖1A組小劑量多巴酚丁胺負荷左心室壁運動超聲影像

2.3 靜息時室壁運動分析結果A組有較多節段出現室壁運動異常，B組未出現室壁運動異常，差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 靜息時心肌左心室壁節段障礙計分

注：A組與B組比較，P<0.01；WMSI—室壁運動計分指數。

2.4 左心室整體收縮功能測定A組術后左室收縮功能降低，表現為射血分數顯著較少，B組術前術后未見明顯變化，差異有統計學意義(P<0.01)。見表3、圖2和圖3。

表3 兩組手術前后慢性冬眠心肌心功能的變化比較

注：與同組術前比較，aP<0.01；與B組術后3個月比較，bP<0.01；LVEF—左室射血分數。

A—A組術前左心功能測定；B—A組術后左心功能測定；EF—左室射血分數。

圖2A組手術前后左心功能比較

A—B組術前左心功能測定；B—B組術后左心功能測定；EF—左室射血分數。

圖3B組手術前后左心功能比較

3 討論

冬眠是心肌缺血時為了避免壞死采取的一種自我保護機制，及時恢復血供可以使缺血心肌功能恢復正?；蚪咏?，延期恢復血供可能使冬眠心肌功能慢性喪失[8-10]。心肌對慢性缺血的反應表現為一種適應的連續統一體，隨著時間的推移，形成一種抗應激表型。有文獻報道，其可以通過上調線粒體解偶聯蛋白-2(UCP-2)，降低鈣調蛋白表達，降低β受體密度等防止缺血引起的氧化應激，但是具體機制還有待進一步研究[11-12]。因此，合適的冬眠心肌模型是開展此實驗的基礎。

犬冬眠心肌模型制備具有天然的優勢。比格犬體型適中，便于操作，其性格溫順，實驗重復性好，適合循環生理、藥理、病理等實驗研究，比格犬冠狀動脈側支循環豐富，術中結扎血管不易因急性心肌缺血而誘發室速、室顫等惡性心律失常[13]。豬的冠狀動脈側支循環少，結扎時易發生惡性心律失常，且豬的冠脈分布與人的相似程度不及犬。兔體積小，冠狀動脈細小，不易分離。因此，比格犬被國際醫學、生物學界公認為是比較理想的實驗動物。

建立慢性冬眠心肌模型的方法為球囊擴張和內膜剝脫，造成LAD狹窄，亦有開胸后使用縮窄環造成前降支慢性縮窄，但兩者均有不足。前者對實驗場地及實驗人員要求高，在X線下進行實驗，實驗人員難以避免受輻射傷害，且花費較高，性價比欠佳；后者采用縮窄環造成前降支慢性閉塞，雖避免輻射傷害，但無法精確控制靶血管縮窄百分比，對后續實驗結果可控性欠佳。

本研究采用開胸絲線結扎法制備犬冬眠心肌模型，通過游標卡尺測量前降支中遠端直徑，匹配不同直徑鋼絲造成前降支75%狹窄，參考相關文獻[14-15]，以稍高于運動當量的運動量，即術后1周輔以每日室外運動4 h(上下午各2 h)，避免以往單純圈養，長期低需氧量狀態造成慢性心肌缺血不充分的問題。冬眠心肌鑒別方法眾多[16-18]，尤以超聲心動圖多巴酚丁胺負荷試驗性價比最高，術后此方法驗證成功造成前降支供血區域心肌產生冬眠現象。此實驗方法簡單，對實驗人員要求較低，花費少，為冬眠心肌領域的后續研究提供了合理的、穩定的模型制備方法。