17β-雌二醇(E2)對大型溞(Daphnia magna)生殖、發育和相關基因轉錄的影響

李曉東，袁思亮，李俊，劉春生

華中農業大學水產學院，武漢 430070

環境中的多種化合物具有內分泌干擾效應，能夠干擾生物體正常的內分泌功能，對個體及其子代產生不良影響，而類雌激素效應物質是環境中最主要的內分泌干擾物。長期以來，由于環境雌激素濃度低、急性毒性小等特點，長期以來不為人們所重視[1]。近些年來，由于環境介質中雌激素物質濃度的逐步升高，釋放到環境中的雌激素效應物質可能會干擾生物體的內分泌系統[2]。畜禽養殖是產生雌激素的重要來源，更值得引起注意的是，由于活禽養殖的糞便被用作土壤肥料，因此造成環境雌激素的廣泛分布，且在眾多環境雌激素中，17β-雌二醇(17β-estradiol, E2)具有較高的生物活性[3]。E2作為最典型的雌激素效應物質，大量應用在生物醫藥領域，并在環境中被頻繁地檢測到且具有較高的環境濃度。與其他污染物類似，E2首先在污水廠進出水口中被檢測到。在德國污水處理廠中，檢測到E2的最高濃度為19 ng·L-1[4]，巴西、意大利和以色列污水處理廠中檢測到的E2濃度分別為21、16.1和141.9 ng·L-1[5-6]。在中國沿海地區，檢測3家污水處理廠進出水口的E2濃度，范圍分別為39.6～90.1 ng·L-1和2.2～54.6 ng·L-1[7-8]。在對地表徑流的檢測中，E2在日本和美國河流中的濃度為1.8～2.1 ng·L-1[9]和9 ng·L-1[10]。在中國天津地區的3條河流以及珠江檢測到E2最高濃度分別為32.4 ng·L-1[11]和7.5 ng·L-1[12]。

大量的毒理學研究證明，水環境中的雌激素物質對魚類[13]和兩棲類[14]等水生脊椎動物有發育毒性、生殖毒性和內分泌干擾效應等多種毒性效應。李國超等[15]報道E2暴露能夠引起斑馬魚中雌性比例上升，并上調部分雌性相關基因的轉錄，下調部分雄性相關基因的轉錄。侯彥峰等[16]報道0.1 ng·L-1E2暴露導致日本青鳉肝臟內卵黃蛋白原基因轉錄顯著上調。樹蛙暴露于E2導致間性個體的出現并干擾肝臟中相關基因的轉錄[17]。徐偉等[18]報道6月齡非洲爪蛙暴露于2.72 μg·L-1E2中6 d，可導致雌性個體輸卵管發生形態改變。目前，有關水體雌激素風險或危害評價研究大多集中在高營養級的水生脊椎動物中[19]，而其對低營養級水生無脊椎動物的毒性效應缺乏系統性的研究和分子機制上的探究。

大型溞(Daphniamagna)是一類小型的枝角類浮游甲殼動物，廣泛分布于亞洲、歐洲、北美洲以及非洲[20-21]，其生命周期和繁殖周期短，繁殖量大，在環境條件良好的狀況下進行孤雌生殖，是一種模式毒理學生物[22]。大型溞作為低等的水生生物，處在水環境食物鏈的中間位置，占據重要生態位。因此，有關大型溞毒性效應的研究對整個水生環境食物鏈具有一定的參考作用[23]。Brennan等[24]報道了E2對大型溞的48 h半致死濃度(48 h-LC50)為2.87 mg·L-1，且1.0 mg·L-1E2暴露21 d顯著降低大型溞存活率至60%，同時E2暴露對大型溞的累積蛻皮個數與累積產卵個數沒有顯著性影響。李根[25]報道了1.28 mg·L-1E2急性暴露抑制了大型溞抗氧化酶的活性，但是21 d慢性暴露對其平均繁殖次數和產溞數沒有顯著性影響。Torres等[26]報道了在巴西Piracicaba河流中E2的濃度為137 ng·L-1，進一步揭示河水中的E2對大型溞有較低的急性毒性風險并強調開展慢性E2暴露的環境風險評估的必要性。已有的有關E2對大型溞毒性效應和環境風險評估的研究僅僅統計了部分表觀指標的改變，而未涉及分子機制上的探究。基于此，本研究在總結已有文獻結果的基礎上，為了進一步探究E2對大型溞的發育和生殖等的毒性效應以及相應的分子機制，選擇0、1.36、13.6、136和1 360 μg·L-1為E2的暴露濃度，開展了為期21 d的慢性暴露實驗。實驗期間，統計并分析了大型溞存活率、累積產溞量、累積蛻皮個數、母代與子代體長、母代與子代游泳速度等終點指標，并利用熒光定量PCR技術(qRT-PCR)評估了大型溞發育和生殖相關基因的轉錄水平，在分子機制上探討了E2對大型溞毒性效應的機理。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 實驗試劑

E2購自日本東京化成工業株式會社，CAS號為50-28-2，純度>97%。有機助溶劑二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司，CAS號為67-68-5，純度>99%。實驗前，取不同量的E2溶解于DMSO中，制備成相應濃度的貯備液，存放于4 ℃。RNA提取所需的RNAiso Plus試劑、反轉錄試劑PrimeScriptTMRT reagent kit及熒光定量試劑SYBR?Primex Ex TaqTMⅡ購自中國TaKaRa公司。此外，RNA提取所用氯仿(CAS號67-66-3)、異丙醇(CAS號67-63-0)和無水乙醇(CAS號64-17-5)均購自中國國藥集團化學試劑有限公司，為國產分析純級。

1.2 大型溞的培養

本研究所用大型溞已在本實驗室中連續培養多代，日常持續培養在光照培養箱中，并設置培養箱內的溫度為(22±1)℃，光照/黑暗時長比為16 h/8 h。大型溞培養所用水體為連續曝氣48 h的過濾自來水。以小球藻(Chlorellapyrenoidosa)和斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)的混合液喂食大型溞，喂養密度為4.5×104cells·mL-1，待到大型溞開始產卵后喂食9.0×104cells·mL-1的小球藻和斜生柵藻的混合液，每天上午喂食一次，每次投喂2 mL。

1.3 慢性暴露實驗

慢性暴露實驗在1 L的玻璃燒杯中進行，按照OECD Test Guideline 211[27]相關指導方案。因為Brennan等[24]報道了E2對大型溞48 h-LC50為2.87 mg·L-1，并且1.0 mg·L-1E2對大型溞21 d慢性暴露沒有引起顯著性效應。因此，為了探究不同濃度范圍的E2暴露對大型溞的影響，本實驗設置了5個濃度梯度，分別為0、1.36、13.6、136和1 360 μg·L-1，每個濃度梯度設置3個平行。采用OECD Test Guideline 211[27]指導方案中的半靜態暴露方法，暴露液每2 d更換一次，每個平行燒杯中含有900 mL暴露液和30只幼溞(<24 h)，對照組和處理組中DMSO濃度均為0.1‰，暴露時間為21 d。暴露期間每天統計大型溞的死亡個數、產溞數以及蛻皮個數，并繪制累積蛻皮曲線和累積產卵曲線。

1.4 體長測量與游泳速度檢測

在暴露的第7、14和21天每個暴露缸取10只溞用于體長的測定，在第21天取10只(<24 h)子一代小溞，用于體長的測定，使用軟件Image Pro Plus和LEICA DFC450C(德國)測量體長，用動物行為儀DanioVision(荷蘭Noldus公司)檢測F0、F1代游泳速度。檢測用24孔板，每個暴露缸取4只溞，每個孔板中放置1只溞，每個濃度組共12個平行。檢測程序設置為25 min，包括5 min黑暗適應時間和2個10 min的光暗循環，每個光暗循環包括5 min光照時間和5 min黑暗時間，在每個5 min光照或黑暗時長中間給予一個輕拍刺激。

1.5 qRT-PCR

21 d暴露結束后，每個暴露缸取10只溞，用TRIzol法提取總RNA，所提取的RNA用Epoch Microplate分光光度計(美國BioTek Instruments, Inc.公司)進行純度檢驗。檢驗方法根據RNA樣品在260 nm/280 nm波長下的比值，若比值在1.90～2.10之間，則確定所得RNA的純度較高，可以用于反轉錄。RNA的濃度則根據260 nm波長下的吸光度數值確定，將所提取的RNA在200 μL EP管中稀釋至100 ng·L-1。反轉錄使用Prime Script RT reagent kits (中國Takara公司)試劑，所需RNA的量為500 ng。將反轉錄所需所有試劑配制為10 μL體系，具體試劑用量如下：5× Prime Script Buffer (for real time) 2 μL、Prime Script RT Enzyme Mix 0.5 μL、Oligo dT Primer (50 μmol·L-1) 0.5 μL、Random 6 mers (100 μmol·L-1) 0.5 μL、RNase Free dH2O 1.5 μL和Total RNA 5 μL。反轉錄體系加樣完成后，經離心后放置在PCR儀中進行反轉錄。PCR儀反應條件設置如下：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。反應完成后得到cDNA，在200 μL EP管中加入RNase Free dH2O 90 μL，cDNA被稀釋10倍，均勻混合后置于-20 ℃中保存備用。qRT-PCR使用SYBR Green Primex Ex TaqⅡ kits(中國Takara公司)試劑。根據SYBR Green Primex Ex TaqⅡ kits試劑盒說明，配制20 μL反應體系：SYBR Green Mix試劑10 μL、DEPC水6 μL、ROX Reference Dye試劑0.4 μL、Primer F 0.8 μL、Primer R 0.8 μL和cDNA 2 μL。將此20 μL體系置于qRT-PCR專用96孔板中，每個濃度組設置3個平行，每個暴露缸中的10只溞混樣為一個平行。qRT-PCR擴增條件設置為：95 ℃，2 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；共計40個循環。數據采用CT值計算，采用2-△△CT法分析。實驗所選取的與蛻皮和生殖有關基因選自相關文獻的報道[28-33]，如表1所示。根據相關文獻的研究，在雌激素物質暴露中，ubc的轉錄水平更為穩定[28]，因此本實驗選定ubc為內參基因。

表1 大型溞生殖和發育有關基因引物序列Table 1 The primer sequences of the genes related to the reproduction and development of Daphnia magna

1.6 數據分析

所有數據均采用SPSS 20.0(SPSS, 芝加哥)軟件進行分析。所有數據均采用單因素方差分析(one-way analysis of variance, ANOVA)方法中的Tukey’s多量程檢驗來確認對照組與暴露組之間的顯著差異，P<0.05定義具有顯著性差異。所有的數據結果均表示為平均值±標準差(mean±SD)。實驗結果中所有圖片均用軟件Prism Graphpad6繪制。

2 結果(Results)

2.1 E2慢性暴露的致死率

如圖1所示，21 d暴露實驗結束，0、1.36、13.6、136和1 360 μg·L-1暴露組大型溞存活率分別為97.78%±1.92%、97.78%±1.92%、98.89%±1.92%、93.33%±6.67%和71.11%±17.10%。與對照組相比，1 360 μg·L-1暴露組大型溞的存活率顯著降低，對大型溞的致死效應顯著。

圖1 17β-雌二醇(E2) 21 d暴露對大型溞的致死效應注：E2濃度為0、1.36、13.6、136和1 360 μg·L-1；數據表達為平均值±標準差；*代表P<0.05，與對照組相比有顯著性差異。Fig. 1 The lethal effect of 17β-estradiol (E2) exposure on Daphnia magna after exposure for 21 dNote: The concentrations of E2 are 0, 1.36, 13.6, 136, 1 360 μg·L-1; data was represented by mean±standard deviation; *represented that the exposure group had significant difference at P<0.05 level when compared with control.

2.2 E2暴露的發育毒性

2.2.1 E2暴露對累積蛻皮個數的影響

如圖2(a)所示，E2暴露21 d后，0、1.36、13.6、136和1 360 μg·L-1暴露組中，平均每只溞的累積蛻皮個數分別為(9.16±0.05)、(8.89±0.05)、(9.00±0.10)、(8.91±0.13)和(8.37±0.28)個。與對照組相比，1 360 μg·L-1暴露組平均累積蛻皮個數降低了8.62%，表明E2暴露能夠顯著地抑制大型溞的蛻皮，減緩其發育過程。

2.2.2 E2暴露對大型溞F0代體長及游泳速度的影響

如圖2(b)所示，0、1.36、13.6、136和1 360 μg·L-1這5個暴露組在第7天時體長分別為(2.41±0.13)、(2.38±0.15)、(2.36±0.13)、(2.33±0.20)和(2.12±0.28) mm。E2暴露對大型溞體長呈現劑量依賴性抑制效應，并且1 360 μg·L-1暴露組中大型溞F0代體長受到顯著抑制。但是在第14天和第21天時暴露組與對照組相比體長均沒有受到顯著性抑制效應，說明E2對大型溞生長發育早期有明顯抑制效應。隨著暴露時間的延長，暴露組與對照組之間的差異逐漸減小。1 360 μg·L-1暴露組與對照組相比，體長雖有所減少，但已經沒有顯著性差異。

如圖2(c)所示，0、1.36、13.6、136和1 360 μg·L-1這5個暴露組中，F0代游泳速度分別為(0.52±0.04)、(0.46±0.10)、(0.53±0.06)、(0.55±0.07)和(0.47±0.03) cm·s-1。所有暴露組與對照組相比，速度均無顯著性差異。

圖2 E2的21 d暴露對大型溞發育的影響注：E2濃度為0、1.36、13.6、136和1 360 μg·L-1；數據表達為平均值±標準差；**代表P<0.01，與對照組相比有顯著性差異。Fig. 2 The effect of E2 exposure on the development of Daphnia magnaNote: The concentrations of E2 are 0, 1.36, 13.6, 136, 1 360 μg·L-1; data was represented by mean±standard deviation; ** represented that the exposure group had significant difference at P<0.01 level when compared with control.

2.3 E2暴露的生殖毒性

2.3.1 E2暴露對大型溞幼溞產量的影響

如圖3(a)所示，暴露21 d后，0、1.36、13.6、136和1 360 μg·L-1這5個暴露組中，平均每只母溞的累積產溞量分別為(13.50±0.68)、(12.96±0.91)、(11.41±0.37)、(13.16±1.38)和(18.28±1.39)個。與對照組相比，1 360 μg·L-1暴露組大型溞平均累積產溞量顯著提高35.40%，表明E2暴露能夠顯著增加大型溞產溞量，干擾大型溞的生殖。

2.3.2 E2暴露對大型溞F1代體長和游泳速度的影響

如圖3(b)所示，0、1.36、13.6、136和1 360 μg·L-1這5個暴露組中，F1代體長分別為(0.84±0.05)、(0.87±0.04)、(0.87±0.05)、(0.85±0.04)和(0.82±0.03) mm。與對照組相比，暴露組F1代體長并無顯著性差異。

如圖3(c)所示，0、1.36、13.6、136和1 360 μg·L-1這5個暴露組中，F1代游泳速度分別為(0.52±0.04)、(0.46±0.10)、(0.53±0.06)、(0.55±0.07)和(0.47±0.03) cm·s-1。與對照組相比，暴露組F1代游泳速度無顯著性差異。

圖3 E2的21 d暴露對大型溞生殖的影響注：E2濃度為0、1.36、13.6、136和1 360 μg·L-1；數據表達為平均值±標準差；*代表P<0.05，與對照組相比有顯著性差異。Fig. 3 The effect of E2 exposure on the reproduction of Daphnia magnaNote: The concentrations of E2 are 0, 1.36, 13.6, 136, 1 360 μg·L-1; data was represented by mean±standard deviation; *represented that the exposure group had significant difference at P<0.05 level when compared with control.

2.4 E2暴露對相關基因轉錄的影響

如圖4(a)所示，在與大型溞發育有關的基因轉錄中，1 360 μg·L-1E2暴露顯著性地降低了大型溞蛻皮激素代謝相關基因cyp18a1(0.42±0.04)和蛻皮激素受體基因hr3(0.52±0.16)的轉錄，同時也降低了大型溞表皮蛋白合成基因cut(0.70±0.66)，并促進了表皮蛋白代謝基因cht(2.05±1.11)和cht3(1.60±0.74)的轉錄，但是與對照組相比沒有統計學上的顯著性差異。在與大型溞生殖有關的基因轉錄中，如圖4(b)所示，所有暴露組中生殖相關基因vtg1、vtg2和vmo1的轉錄均與對照組無顯著性差異。

圖4 E2的21 d暴露對大型溞發育(a)和生殖(b)相關基因轉錄的影響注：E2濃度為0、1.36、13.6、136和1 360 μg·L-1；數據表達為平均值±標準差；*代表P<0.05，與對照組相比有顯著性差異。Fig. 4 The effect of E2 exposure on the transcriptions of genes relevant to development (a) and reproduction (b) of Daphnia magnaNote: The concentrations of E2 are 0, 1.36, 13.6, 136, 1 360 μg·L-1; data was represented by mean±standard deviation; *represented that the exposure group had significant difference at P<0.05 level when compared with control.

3 討論(Discussion)

本研究依據OECD Test Guideline 211[27]測試方法，評價了E2對大型溞存活、發育和生殖的影響。結果表明，只有最高濃度組(1 360 μg·L-1E2)中，暴露21 d后大型溞會有顯著死亡，其死亡率約為30%，說明高濃度E2對大型溞有顯著致死效應。Brennan等[24]曾報道1.0 mg·L-1E2暴露21 d可對大型溞產生40%的致死率，與本研究結果基本一致。李根[25]探究了E2急性暴露對大型溞抗氧化酶系統的影響，發現0.64 mg·L-1E2暴露48 h會抑制大型溞幼溞過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽S-轉移酶(GST)等抗氧化酶的活性，這說明E2暴露可能會通過影響大型溞氧化應激水平，降低大型溞的存活率。

蛻皮是大型溞生殖和發育所必需的重要生理過程，蛻皮后大型溞體長增加，卵囊空間增大，有利于其生長和產卵[34]。本研究結果表明，E2顯著地抑制

了大型溞的平均累積蛻皮個數，此外，E2暴露7 d顯著抑制了F0代大型溞的個體生長，但是隨著暴露時間延長，處理組和對照組體長之間的差異逐漸縮小，這說明E2可能對大型溞早期發育抑制效應更為顯著，從而導致其發育減緩。對于E2的生殖毒性，本研究表明，E2暴露會導致大型溞21 d累積產溞數顯著升高，但對F1子代的個體生長和運動行為沒有影響。這說明，E2能干擾F0代大型溞的生殖能力，但E2的母代暴露不會影響子代的發育。相關研究用1 mg·L-1E2連續染毒兩代大型溞，發現F0代產溞量沒有顯著變化，但是暴露至F1代時，其產溞量與F0代相比，顯著性降低[30]。本研究與此研究結果的差異可能是由暴露方式和濃度不同導致的，但兩者均說明E2暴露會對大型溞產生生殖毒性。

為進一步探究E2對大型溞毒性效應的分子機制，本研究利用qRT-PCR技術對大型溞蛻皮和生殖相關基因的轉錄進行了評價。大型溞蛻皮主要受20-羥基蛻皮激素(20-HE)的直接控制[35]，并且蛻皮激素在蛻皮過程中的代謝對大型溞的蛻皮至關重要[36]。在大型溞中，cyp18a1負責編碼將蛻皮激素20-HE催化成26-羧基酸的酶[36]，因此，cyp18a1轉錄結果的降低會干擾大型溞蛻皮激素20-HE的正常代謝。蛻皮激素20-HE與蛻皮激素受體(EcR)和超氣門蛋白(USP)共聚物結合后引發蛻皮激素受體基因hr3的轉錄[37]。蛻皮激素受體基因hr3是引發蛻皮激素下游信號通路的非常關鍵的基因，當沉默hr3基因時，可以導致蛻皮的延遲和失敗[38-39]。在本研究中，E2暴露顯著地降低了cyp18a1及hr3這2個基因的轉錄，這與1 360 μg·L-1E2處理組中累積蛻皮個數減少的結果一致。在大型溞中，一個完整的蛻皮過程包括舊有的表皮水解、角質蛋白分泌、舊蛋白水解與重吸收、舊表皮脫落以及新的表皮形成等過程[39]。其中，cut基因負責角質蛋白的生成[37]，cht和cht3基因負責水解角質蛋白[31]。本研究中，E2暴露導致cut轉錄的下調和cht轉錄的上調，繼而可能導致了大型溞舊表皮水解和新角質蛋白分泌過程被干擾，最終減少了大型溞蛻皮個數，抑制了大型溞的蛻皮。Zou和Fingerman[40]曾指出，在大型溞中，具有多個苯環的外源性化學物質可以與蛻皮激素受體結合，對內源性蛻皮激素產生拮抗作用，干擾正常的蛻皮過程[40]。Mu和Leblanc[41]總結了他們之前的研究，認為能夠表現出干擾蛻皮激素代謝或者與蛻皮激素產生拮抗效應的外源性化學物質對大型溞可以表現出蛻皮抑制和生殖干擾作用[41-44]。然而，qRT-PCR結果顯示，E2暴露并未對大型溞生殖相關基因vtg1、vtg2和vmo1基因的轉錄有顯著性影響。這表明，E2主要是通過干擾大型溞蛻皮激素的代謝，從而影響了大型溞的蛻皮和生殖周期，并干擾了大型溞的生殖能力。

綜上所述，1 360 μg·L-1E2暴露對大型溞產生了明顯的致死效應，以及較高的生殖毒性效應和較低的發育毒性效應。此外，1 360 μg·L-1暴露抑制了大型溞蛻皮激素代謝關鍵基因cyp18a1和蛻皮激素受體基因hr3的轉錄，干擾了蛻皮激素代謝，并且抑制了大型溞表皮蛋白合成基因cut的轉錄，同時促進了大型溞表皮蛋白分解基因cht、cht3的轉錄，從而干擾了大型溞蛻皮和生殖。同時，E2暴露顯著地促進大型溞產卵量，干擾了大型溞正常的生殖過程。以上結果表明，E2暴露對大型溞產生較低的環境風險。

本研究揭示了E2對大型溞生殖、發育及相關基因轉錄的影響，為環境中E2的風險評估提供了相關的理論依據。有關E2暴露對大型溞生殖發育影響的具體分子機制需要進一步的研究。同時，由于自然界中化學物質的多樣性和持續存在性，聯合暴露和多代暴露在進一步的研究中也具有重要意義。