microRNA-125b在舌鱗狀細胞癌中的表達及意義

王健 閆廣鵬 郭超 李軍

1.新疆維吾爾自治區人民醫院口腔頜面外科，烏魯木齊 830001；

2.石河子大學第一附屬醫院口腔頜面外科， 石河子 832000

舌鱗狀細胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）是口腔頜面部最常見的腫瘤[1-4]，約占口腔頜面部惡性腫瘤的50%～60%，全身惡性腫瘤的0.8%～2%，每年威脅著近50萬人的生命[5]。TSCC經常導致患者咀嚼、言語和吞咽功能障礙，其惡性程度較高，侵襲性強，極易發生頸淋巴結遠處轉移[6-9]。近年來手術、放化療水平已經取得巨大進步，但由于較高的局部區域性復發和頸部淋巴結轉移，與過去的30年相比，患者的預后并沒有得到提高[10]。隨著分子生物學的發展，研究[11-14]發現，微小RNA在許多生理和病理過程中起著至關重要的作用，包括發育和細胞增殖、凋亡、侵襲、代謝等。實驗[15]表明，多種類型的微小RNA分子通過沉默或者抑制癌基因表達的方式，參與到癌細胞生物程序的調控之中。有研究[16]發現，不同腫瘤中microRNA-125b的表達不同；還有研究[17]證實，口腔鱗狀細胞癌中microRNA-125b可起到抑癌基因作用，在癌細胞中表達下調。Brito等[18]發現，在約80.0%的口腔和口咽腫瘤樣本與非腫瘤樣本中的microRNA-125b表達相近，microRNA-125b表達上調患者的總體生存率更高，但該結果未達到統計學意義。盡管如此，microRNA-125b仍然被認為能調節細胞增殖和凋亡。在同樣是口腔鱗狀細胞癌范疇的TSCC中，microRNA-125b的表達情況國內外鮮見公開報道。本實驗通過實時熒光定量聚合酶鏈反應（real time fluorescence-quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）及原位雜交（in situ hybridization，ISH）技術檢測TSCC及對應的癌旁正常組織中microRNA-125b的表達情況，并分析其與臨床病理的相關性。

1 材料和方法

1.1 臨床標本

收集自2016年8月—2018年1月在新疆維吾爾自治區人民醫院口腔頜面外科手術切除的TSCC組織及相對應的癌旁正常組織（距離切緣＞2 cm）共計35例，其中男性10例，女性25例，從34～75歲不等，平均年齡為（57.8±6.2）歲?；颊咝g前無長期服用非甾體類抗炎藥物史，無其他同時存在的惡性腫瘤，未進行放化療及免疫治療。術后標本經病理科進行病理學診斷，明確診斷為TSCC，其中高分化16例，中分化10例，低分化9例，癌旁組織經病理診斷為正常組織。參照2002年國際抗癌聯盟制訂的口腔癌TNM分期標準進行病理分級分期。

1.2 主要試劑

RT-qPCR主要試劑：Rneasy MiNi Kit RNA提取試劑盒、miScript Ⅱ RT Kit逆轉錄試劑盒、miScript SYBR? Green PCR Kit擴增試劑盒、microRNA-125b特異性引物、U6內參均購自德國Qiagen公司。ISH主要試劑：石蠟、無水乙醇、二甲苯、十二烷基磺酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉、醋酸酐、三乙醇胺、聚乙烯毗鉻烷酮均購自上海國藥集團化學試劑有限公司，焦炭酸二乙酯購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，二硫蘇糖醇、去離子甲酰胺、聚蔗糖均購自韓國BIOSHARP公司，鮭魚精DNA購自美國Sigmaaldrich公司，蛋白酶K購自瑞士Roche公司，甘氨酸購自德國Biofroxx公司。探針名稱為HSA-MIR-125B-5P，其序列（5'—3'）為/5DiGN/CACAAGTTAGGGTCTCAGGGA/3DiGN/。

1.3 RT-qPCR實驗

取60 mg凍存的TSCC組織及癌旁正常組織，液氮研磨至粉末，刀片刮到EP管中。加入700 μL QIAzol Lysis后充分勻漿，按照Rneasy MiNi Kit RNA提取試劑盒說明書步驟提取TSCC組織及癌旁正常組織的總RNA，并用分光光度儀進行濃度和純度的檢測，計算在反轉錄中的使用量。

將提取的總RNA置于冰上，按5×miScript HiFlex Buffer 4 μL，10×miScript核酸混合物2 μL，無酶無菌水Variable，miScript逆轉錄酶混合物2 μL，Template RNA Variable（根據無酶無菌水的量來配置），配置反轉錄體系，總體積為20 μL。加RNA，輕柔混勻，簡單離心，放于冰上，37 ℃孵育60 min，然后置于95 ℃ 5 min以滅活酶，加30 μL水稀釋后用于RT-qPCR擴增。引物序列由德國Qiagen公司提供，反應總體系為20 μL，在QIAGEN RGQ5 PLUS HRM儀上擴增。反應程序為：95 ℃預變性15 min，進入循環，94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 min，70 ℃延伸30 s，采集熒光，共40個循環； 60～95 ℃融解，將內參調整為U6，用2-ΔΔCT相對定量法檢測不同組織microRNA-125b表達的差異，每個樣本3個重復孔。

1.4 ISH實驗

所有TSCC組織及癌旁組織經4%甲醛溶液固定，組織經常規脫水透明浸蠟后包埋于石蠟塊中，切面在凍臺上冷凍幾分鐘后，用切片機切片，切片厚度控制在4 μm，將切好的切片貼附于載玻片上，于60 ℃烤箱烤片3 h。先后用二甲苯、無水乙醇、蒸餾水將切片進行脫蠟處理。脫蠟后的切片用 0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PB）漂洗3次，每次5 min。加入0.3% Triton X-100-0.1 mol·L-1PB中15 min，去污，1 μg·mL-1蛋白酶K消化30 min（37 ℃）。4%多聚甲醛（加0.1 mol·L-1PB液配制）室溫下終止消化和再固定5 min。0.1 mol·L-1PB（pH=7.2）沖洗3次，每次5 min，0.25%醋酸酐處理10 min。分別采用4×檸檬酸鈉緩沖液（saline sodium citrate，SSC）漂洗 5 min，2×SSC漂洗10 min，滴加預雜交液（不含探針）于切片上，密封濕盒內45 ℃下預雜交2 h。雜交液配制如下：在雜交緩沖液中加入適量地高辛標記microRNA-125b探針，使探針終濃度為0.5～1 μg·mL-1，將混勻后的雜交液滴加在切片上（覆蓋組織），或將切片漂浮于雜交液中，于密封濕盒內45 ℃下雜交24 h。雜交后沖洗：5×SSC液漂洗15 min（45 ℃）；4×SSC漂洗15 min（37 ℃）；2×SSC（含50%去離子甲酰胺）漂洗15 min（37 ℃）；1×SSC（含20 μg·mL-1RNaseA）沖洗15 min（37 ℃）；0.5×SSC沖洗15 min（37 ℃）；0.01 mol·L-1PBS液室溫漂洗3次，每次5 min。顯示：堿性磷酸酶標記地高辛抗體Fab片段室溫下孵育4 h；0.01 mol·L-1PBS漂洗4次，每次5 min；TSM1漂洗2次，每次5 min；TSM2漂洗2次，每次5 min；氯化硝基四氮唑藍（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽（5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate，BCIP）顯色液中室溫下顯色0.5～2 h，顯微鏡下觀察顯色情況以決定終止或延長顯色時間；0.01 mol·L-1PBS沖洗2次，每次5 min；明膠甘油封片，二甲苯透明，樹脂封片。

1.5 統計學分析

使用SPSS 17.0軟件進行數據分析，計量資料采用均數±標準差表示，兩組間比較采用配對樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，年齡與表達量的關系采用相關性分析，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 TSCC組織及癌旁正常組織microRNA-125b的表達差異

RT-qPCR結果顯示，TSCC組織中microRNA-125b的相對表達量為2.32±0.69，癌旁正常組織中microRNA-125b的相對表達量為0.87±0.32，經統計學分析，TSCC組織中microRNA-125b的表達顯著高于癌旁正常組織（t=11.099，P＜0.001）。

2.2 microRNA-125b表達與臨床病理特征的相關性

35例TSCC中microRNA-125b的相對表達量為2.32±0.69，與年齡、性別、病理分級和淋巴結轉移無明顯相關性，而與TNM分期呈明顯正相關，TNM分期越高，其microRNA-125b的相對表達量越高（表1）。

表1 TSCC microRNA-125b表達與臨床病理特征的關系Tab 1 Relationship between the expression of TSCC microRNA-125b and the clinicopathological features

2.3 ISH結果與分析

NBT和BCIP顯色液顯色后，用microRNA-125b探針雜交的細胞質內呈紫藍色反應產物，micro RNA-125b在TSCC組織中上調（圖1）。用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件測量染色信號密度，35例患者的癌組織平均密度為0.010±0.003，而癌旁正常組織的平均密度為0.004±0.001。該結果表明與其癌旁正常組織相比，TSCC組織中microRNA-125b表達水平增高（P＜0.05）。

3 討論

舌癌是口腔頜面部常見惡性腫瘤之一，常發于舌緣，其次為舌尖和舌背，位于舌前2/3的為口腔癌范疇，多為鱗狀細胞癌。臨床上TSCC的治療方法仍然是以手術治療為主，輔助陽性切緣和靜脈、淋巴或神經浸潤的檢測，術后聯合放化療的綜合治療[19]。然而舌體組織具有豐富的淋巴和血液循環，且舌體活動頻繁，使其具有早期轉移和局部復發的特點[20]。隨著醫學科技的不斷進步，治療舌癌的手段和水平不斷得到發展，但由于TSCC較高的轉移和復發率，對晚期TSCC和無法耐受手術及術后放化療的患者缺乏有效的治療手段，導致患者術后5年生存率并沒有得到顯著提高[21]，因此研究TSCC的發生和發展機制對于預防和治療來說至關重要。從目前研究看來，TSCC的發病機制較為復雜，有環境因素作用，有局部刺激因素作用，有自身免疫體質因素，也有基因突變因素等。隨著分子生物學的發展，微小RNA的發現，使人們對疾病的研究又有了新的微觀視角。

圖1 TSCC及癌旁正常組織中microRNA-125b的表達 ISHFig 1 Expression of microRNA-125b in the TSCC tissues and adjacent normal tissues ISH

微小RNA是約22個核苷酸的非編碼單鏈RNA，通過與靶mRNA的30個非翻譯區（30UTR）結合，抑制mRNA翻譯或降解mRNA分子來調節表達[22]。目前已經發現，通過調控人類基因表達水平的變化可影響人類的發育及疾病的發生發展[23-26]。微小RNA在人類惡性腫瘤的發生發展中發揮重要作用，在已發現的各種不同類型腫瘤中存在異常表達[27]，支持其具有顯性或隱性癌基因的功能[28]；其中microRNA-125b在頭頸部惡性腫瘤的發生發展中起到重要的作用，能在轉錄水平調控基因的表達[29]。microRNA-125b主要通過作用于細胞的增殖、分化和凋亡等，直接影響腫瘤的發生發展。作為一種抑癌基因，microRNA-125b在皮膚鱗狀細胞癌、口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）、軟骨肉瘤、黑素瘤、肝癌及白血病中表達下調[17]。He等[30]的研究發現，microRNA-125b在卵巢癌組織中低表達，通過在卵巢癌細胞中過表達microRNA-125可以抑制腫瘤誘導的血管生成，從而促進卵巢癌細胞凋亡，這與人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）和人類表皮生長因子受體3（human epidermal growth factor receptor-3，HER3）的表達密切相關。Zhao等[31]檢測了膀胱癌患者癌組織以及癌旁正常組織中microRNA-125b的表達，結果發現，microRNA-125b在腫瘤組織中的表達低于正常組織。Shiiba等[32]報道，在OSCC衍生的細胞系和OSCC樣品中microRNA-125b的下調表達，可以降低OSCC衍生的細胞增殖率，并且可以增強放射敏感性和減少細胞間黏附分子-2（intercellular cell adhesion molecule 2，ICAM2）-mRNA的表達；此外，microRNA-125b表達與OSCC腫瘤分期和生存相關。閻文婷等[33]發現，在胃癌組織中microRNA-125b表現為高表達，且在胃癌細胞系中過表達microRNA-125b后，胃癌細胞的增殖能力顯著增加，同時細胞凋亡也明顯受到抑制。

目前認為，microRNA-125b在OSCC中為抑癌基因作用，但其作用尚存爭議。筆者結合本地區TSCC的現況，探討TSCC組織中microRNA-125b的表達情況。本研究采用RT-qPCR法對35例TSCC及其相應癌旁正常組織樣本中的microRNA-125b的相對表達量進行檢測，并進行對比分析，結果發現，TSCC組織中的microRNA-125b的相對表達量較癌旁正常組織顯著增高。對TSCC中microRNA-125b的表達與年齡進行相關性分析，發現microRNA-125b的表達與年齡無明顯相關性（P＞0.05）；將10例男性和25例女性TSCC組織中microRNA-125b的相對表達量進行分析，發現其表達與性別也無明顯相關性（P＞0.05）。此外，本研究還證實，microRNA-125b表達與腫瘤分化程度和有無淋巴結轉移也無明顯相關性，但與腫瘤的TNM分期有相關性，TNM分期越高，腫瘤的惡性程度越高，microRNA-125b表達量亦越高。ISH是通過帶有標記物的核酸探針來檢測待測組織中核酸的表達及分布情況，是定性分析微小RNA表達的方法之一。本研究通過ISH發現，相對于癌旁組織，TSCC組織中microRNA-125b表達明顯上調。本研究初步證明了microRNA-125b在TSCC組織是有表達且高表達的，提示microRNA-125b在TSCC發病中起促癌基因的作用，與microRNA-125b在OSCC中起抑癌基因作用的報道相反。筆者認為，OSCC是一個很大范疇的疾病，包括頰黏膜、上下牙齦、硬腭和舌等多個部位的鱗狀細胞癌，在不同的解剖分區microRNA-125b的表達及作用可能會有不同。細胞增殖、分化及凋亡異常會導致腫瘤的發生，而侵襲和遷徙功能的紊亂會導致淋巴轉移和復發。microRNA-125b通過調控作用于上下游相關蛋白形成一個巨大的調控網絡，具體的調控作用機制仍需進一步的研究去證實。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。