黏著斑激酶抑制劑TAE226對(duì)人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

鄒湘渝 曾琴 劉萍 聶敏海

1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周黏膜科，瀘州 646000；

2.西南醫(yī)科大學(xué)口頜面修復(fù)重建與再生實(shí)驗(yàn)室，瀘州 646000；

3.深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院口腔科，深圳 518000

黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）是一種非受體酪氨酸激酶，通過(guò)整合來(lái)自胞外的壓力、細(xì)胞黏著等方面的信號(hào)，參與腫瘤的增殖、遷移、侵襲和血管再生等有關(guān)的多條信號(hào)傳導(dǎo)通路，目前已成為腫瘤診斷的分子標(biāo)志物和惡性腫瘤治療的重要靶點(diǎn)[1-2]。TAE226是一種針對(duì)FAK的強(qiáng)效抑制劑，可以有效阻斷FAK信號(hào)通路[3]。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)TAE226對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）具有明顯的抗增殖、遷移和侵襲作用，但對(duì)發(fā)生在OSCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移階段的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transi tion，EMT）進(jìn)程的作用尚不清楚。本研究采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和蛋白質(zhì)印跡法（Western blot），探究TAE226在OSCC細(xì)胞EMT過(guò)程中的作用及其意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人OSCC HSC-3、HSC-4細(xì)胞株（由四川大學(xué)口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供）。TAE226（上海藍(lán)木化工有限公司），優(yōu)質(zhì)胎牛血清、PBS緩沖液（北京索萊寶生物科技有限公司），DMEM高糖培養(yǎng)基（賽默飛世爾生物化學(xué)制品北京有限公司），DMSO（AMRESCO公司，美國(guó)），RNA提取試劑盒（天根生化科技北京有限公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑（TOYOBO公司，日本），QuantiFast SRBR Green PCR Kit（QIAGEN公司，德國(guó)）， Anti-E-cadherin抗體、Anti-Vimentin抗體（Abcam公司，英國(guó)），二抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）檢測(cè)試劑盒（Millipore公司，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 TAE226的配置及實(shí)驗(yàn)分組 用10.67 mL DMSO溶解5 mg TAE226，配成濃度為1 mmol·L-1的TAE226母液，分裝后于-20 ℃冰箱中保存。臨用前按比例用培養(yǎng)液將其稀釋，并使其中DMSO液的含量低于0.1%。本實(shí)驗(yàn)將1、5、10 μmol·L-1濃度的TAE226培養(yǎng)液作為實(shí)驗(yàn)組，將不含TAE226（0 μmol·L-1）的培養(yǎng)液作為對(duì)照組。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和鋪板 HSC-3、HSC-4細(xì)胞株由含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，每2天換液1次，待細(xì)胞融合度80%～90%時(shí)，消化傳代。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSC-3細(xì)胞制備成細(xì)胞濃度為3×105個(gè)·mL-1的細(xì)胞懸液，按每孔2 mL接種于六孔板內(nèi)。培養(yǎng)24 h至貼壁后，棄原培養(yǎng)液，PBS液洗2遍后分別加入含TAE226 0、1、5、10 μmol·L-1的培養(yǎng)液每孔3 mL，搖勻置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)用于EMT標(biāo)志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）mRNA的檢測(cè)，并對(duì)培養(yǎng)48 h的細(xì)胞進(jìn)行E-cadherin和Vimentin蛋白檢測(cè)。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 按RNA提取試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行操作。分別在HSC-3和HSC-4細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)將其取出，置于顯微鏡下觀察其生長(zhǎng)情況并拍照，用PBS液洗2遍，按每孔1 mL向六孔板中加入Trizol液以裂解細(xì)胞，提取總RNA，并于微量分光光度計(jì)上檢測(cè)RNA的純度及濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)而擴(kuò)增E-cadherin和Vimentin的mRNA。反應(yīng)體系：總RNA模板2 μL（1 μg），蒸餾水6.4 μL，SRBR Green Real time PCR Master Mix 10 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL。設(shè)置2個(gè)復(fù)孔，擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性30 s，57 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)定量PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)并合成（表1）。以目的基因的相對(duì)表達(dá)量（2-ΔΔCT）計(jì)算出各基因相對(duì)表達(dá)水平，其中ΔCT=CT目的基因-CT內(nèi)參基因，ΔΔCT=ΔCT實(shí)驗(yàn)組-ΔCT對(duì)照組。

表1 引物序列和產(chǎn)物Tab 1 Sequences of primers and products

1.2.4 Western blot檢測(cè) 培養(yǎng)HSC-3和HSC-4細(xì)胞48 h后取出六孔板于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，拍照，將其用PBS液洗2遍，按每孔250 μL向六孔板中加入蛋白裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，在蛋白液內(nèi)加入適量的5×蛋白上樣緩沖液（蛋白液∶5×蛋白上樣緩沖液為4∶1），95～100 ℃干鍋浴5 min進(jìn)行變性。聚丙烯酰胺凝膠電泳，切膠、轉(zhuǎn)至PVDF膜。脫脂牛奶室溫封閉2 h，4 ℃孵育一抗過(guò)夜，TBST漂洗PVDF膜5次，每次5 min。室溫孵育二抗1 h，TBST洗膜。ECL混合溶液避光孵育1 min，置于凝膠成像系統(tǒng)成像拍照。將拍攝的圖片保存，用AlphaEase FC軟件測(cè)量灰度值，并計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。將目的蛋白的光密度值/內(nèi)參的光密度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)豐度。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多因素多組間的比較采用重復(fù)變量的方差分析，單因素多組間的比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 HSC-3和HSC-4細(xì)胞在TAE226作用下細(xì)胞形態(tài)的變化

對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)快速，彼此緊密貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞呈短梭形或菱形，細(xì)胞膜和細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，胞質(zhì)飽滿且透亮。加入了TAE226的HSC-3/HSC-4細(xì)胞培養(yǎng)后，隨著TAE226濃度不斷增加，細(xì)胞體積逐漸皺縮變小，細(xì)胞膜邊界不清，細(xì)胞固縮成圓形、長(zhǎng)梭形、橢圓形或鏤空狀，最后呈蜂窩樣空洞性連接并出現(xiàn)大量脫落漂浮細(xì)胞，基本上無(wú)貼壁細(xì)胞（圖1）。

圖1 不同濃度的TAE226干預(yù)72 h后的HSC-3、HSC-4細(xì)胞 顯微鏡 × 200Fig 1 HSC-3 and HSC-4 cells were observed after 72 h intervention with TAE226 at different concentrations microscope × 200

2.2 TAE226作用下HSC-3和HSC-4細(xì)胞E-cadherin和Vimentin mRNA的表達(dá)

TAE226作用下HSC-3細(xì)胞E-cadherin和Vimentin mRNA的表達(dá)見(jiàn)表2、3。從表2、3可見(jiàn)，1）除對(duì)照組（0 μmol·L-1TAE226）在TAE226作用24 h和48 h時(shí)，E-cadherin mRNA的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，其他不同濃度和不同時(shí)間的比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），E-cadherin mRNA的表達(dá)隨TAE226作用時(shí)間和濃度的增加而表達(dá)增加。2）對(duì)照組Vimentin mRNA的表達(dá)隨時(shí)間增加而升高（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組Vimentin mRNA的表達(dá)低于對(duì)照組（P＜0.05），且隨時(shí)間和濃度的增加而表達(dá)降低（P＜0.05）。

TAE226作用下HSC-4細(xì)胞E-cadherin和Vimentin mRNA的表達(dá)見(jiàn)表4、5。從表4、5可見(jiàn)，1）對(duì)照組E-cadherin mRNA的表達(dá)隨著時(shí)間增加而降低（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組E-cadherin mRNA的表達(dá)高于對(duì)照組（P＜0.05），且隨TAE226作用時(shí)間和濃度的增加而表達(dá)增加（P＜0.05）。2）對(duì)照組Vimentin mRNA的表達(dá)隨著時(shí)間增加而增加（P＜0.05），除實(shí)驗(yàn)組1 μmol·L-1TAE226作用24 h時(shí)Vimentin mRNA的表達(dá)與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，其他不同濃度和不同時(shí)間的比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組Vimentin mRNA的表達(dá)低于對(duì)照組，且隨時(shí)間和濃度的增加表達(dá)降低（P＜0.05）。

表2 TAE226作用下HSC-3細(xì)胞的E-cadherin mRNA表達(dá)Tab 2 The relative expression of E-cadherin mRNA in HSC-3 cells with TAE226

2.3 TAE226作用下HSC-3、HSC-4細(xì)胞E-cadherin、Vimentin蛋白的表達(dá)

TAE226作用下HSC-3、HSC-4細(xì)胞的E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)見(jiàn)圖2、3和表6、7。HSC-3、HSC-4細(xì)胞的E-cadherin蛋白的表達(dá)隨TAE226濃度的增加而增加（P＜0.05），Vimentin蛋白的表達(dá)隨TAE226濃度的增加而降低（P＜0.05）。表明，TAE226對(duì)HSC-3細(xì)胞和HSC-4細(xì)胞的E-cadherin的蛋白表達(dá)有促進(jìn)作用，對(duì)Vimentin的蛋白表達(dá)有抑制作用，且該效應(yīng)具有劑量依賴性。

表3 TAE226作用下HSC-3細(xì)胞Vimentin mRNA的表達(dá)Tab 3 The relative expression of Vimentin mRNA in HSC-3 cells with TAE226

表4 TAE226作用下HSC-4細(xì)胞E-cadherin mRNA的表達(dá)Tab 4 The relative expression of E-cadherin mRNA in HSC-4 cells with TAE226

3 討論

OSCC作為口腔頜面部最常見(jiàn)的惡性腫瘤，癌細(xì)胞易從原發(fā)部位經(jīng)淋巴道、血管或體腔等途徑，到其他部位生長(zhǎng)、定植并最終形成新的腫瘤病灶，即OSCC早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響預(yù)后[4-5]。研究[6]表明，EMT在腫瘤轉(zhuǎn)移，尤其是單個(gè)腫瘤細(xì)胞從腫瘤組織上脫離的過(guò)程中起著重要作用。EMT作為生物胚胎發(fā)生過(guò)程中最基本的過(guò)程，在許多慢性病及惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展中亦發(fā)揮重要作用。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)，上皮細(xì)胞失去極性，細(xì)胞之間黏附連接能力下降，演變?yōu)榫哂虚g質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和特性的細(xì)胞，并獲得了浸潤(rùn)性和游走遷移能力，進(jìn)而增強(qiáng)了侵襲和轉(zhuǎn)移的能力[7]。

表5 TAE226作用下HSC-4細(xì)胞Vimentin mRNA的表達(dá)Tab 5 The relative expression of Vimentin mRNA in HSC-4 cells with TAE226

圖2 Western blot檢測(cè)HSC-3細(xì)胞E-cadherin及Vimentin蛋白的表達(dá)Fig 2 Level of E-cadherin and Vimentin protein expression in HSC-3 cells by Western blot

圖3 Western blot檢測(cè)HSC-4細(xì)胞E-cadherin及Vimentin蛋白的表達(dá)量Fig 3 Level of E-cadherin and Vimentin protein expression in HSC-4 cells by Western blot

表6 HSC-3細(xì)胞E-cadherin及Vimentin蛋白的表達(dá)（灰度比值）Tab 6 Grayscale ratio of E-cadherin and Vimentin protein in HSC-3 cells

表7 HSC-4細(xì)胞E-cadherin及Vimentin蛋白的表達(dá)（灰度比值）Tab 7 Grayscale ratio of E-cadherin and Vimentin protein in HSC-4 cells

FAK是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶，是細(xì)胞內(nèi)重要的骨架蛋白與多種信號(hào)通路的關(guān)鍵分子。FAK在整合生長(zhǎng)和細(xì)胞基質(zhì)黏附信號(hào)方面具有關(guān)鍵作用，是癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移的主要驅(qū)動(dòng)力，目前已成為研究抗腫瘤藥物的重要靶點(diǎn)之一[8]。TAE226是針對(duì)FAK的一種ATP競(jìng)爭(zhēng)性酪氨酸激酶抑制劑。Lietha等[9]在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以及體內(nèi)動(dòng)物模型誘癌實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，TAE226可有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)及侵襲，延長(zhǎng)膠質(zhì)瘤或卵巢腫瘤植入小鼠的壽命。Hehlgans等[10]研究也發(fā)現(xiàn)，TAE226作用于三維細(xì)胞培養(yǎng)模型中的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（squa mous cell carcinoma of the head and neck，HNSCC）細(xì)胞后，細(xì)胞的放射敏感性增強(qiáng)，這也說(shuō)明TAE226在臨床上可能會(huì)提高HNSCC放射治療的有效性。Kurio等[11]研究發(fā)現(xiàn)，TAE226可抑制破骨前細(xì)胞RAW264.7轉(zhuǎn)變?yōu)槠乒羌?xì)胞，抑制成熟破骨細(xì)胞的微核和肌動(dòng)蛋白環(huán)的形成，提示TAE226在破骨前細(xì)胞、成熟破骨細(xì)胞、骨基質(zhì)細(xì)胞中均參與了溶骨性轉(zhuǎn)移和活化，可有效治療腫瘤性骨轉(zhuǎn)移。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，TAE226對(duì)OSCC細(xì)胞有明顯的抗增殖、遷移、侵襲作用，本實(shí)驗(yàn)旨在研究TAE226對(duì)OSCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移階段的EMT進(jìn)程是否有抑制作用，探索TAE226的抗癌機(jī)制，以期為T(mén)AE226的臨床應(yīng)用提供依據(jù)，為口腔黏膜癌變的防治提供新的策略。

腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)伴有多種上皮標(biāo)志物的下調(diào)，如E-cadherin、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）等，同時(shí)間質(zhì)標(biāo)記物上調(diào)，包括N-cadherin、Vimentin、纖連蛋白等[12-14]。E-cadherin是廣泛分布于上皮組織的跨膜糖蛋白，是一種維持上皮細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)的完整性和極性的細(xì)胞黏附分子，Hermiston等[15]發(fā)現(xiàn)E-cadherin表達(dá)水平的降低可顯著増強(qiáng)小鼠卵巢癌細(xì)胞株體外遷移能力。Perl等[16]在Rip-Tag小鼠實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了E-cadherin表達(dá)下調(diào)是腺瘤進(jìn)展為浸潤(rùn)性癌的先決條件。E-cadherin的表達(dá)與腫瘤的分化程度、發(fā)展轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，E-cadherin表達(dá)缺失或降低可使腫瘤細(xì)胞黏附能力下降，促進(jìn)上皮性腫瘤細(xì)胞順利實(shí)現(xiàn)浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移，是腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制因素，也是EMT發(fā)生的關(guān)鍵性蛋白，E-cadherin轉(zhuǎn)錄的抑制是EMT的主要機(jī)制[17]。Vimentin是一種進(jìn)化上保守的中間纖維蛋白，作為一種重要的骨架蛋白以維持細(xì)胞的完整性，與細(xì)胞骨架構(gòu)成和細(xì)胞黏附密切相關(guān)[18]。Vimen tin主要表達(dá)于間充質(zhì)，在正常上皮組織中不表達(dá)或低表達(dá)，是間質(zhì)型細(xì)胞的標(biāo)志蛋白之一。研究[19]表明，當(dāng)Vimentin表達(dá)于上皮源性的腫瘤細(xì)胞時(shí)，賦予了上皮源性細(xì)胞成纖維細(xì)胞樣的特征，使細(xì)胞更易遷移和運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞間黏附能力下降，遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變，因此E-cadherin、Vimentin的表達(dá)水平反映了腫瘤細(xì)胞EMT的發(fā)生程度。在已有的相關(guān)研究中，不同細(xì)胞所用的TAE226濃度不盡相同，從500 nmol·L-1至10 μmol·L-1不等[20]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，1 μmol·L-1的TAE226對(duì)HSC-3細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲已有明顯的抑制效果，本實(shí)驗(yàn)為尋找適宜的濃度，設(shè)置1 μmol·L-1到10 μmol·L-1作為檢測(cè)濃度。在本實(shí)驗(yàn)中，TAE226作用下的人OSCC HSC-3細(xì)胞的上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)增加及間質(zhì)標(biāo)志物Vimen tin表達(dá)下降，且該藥物效應(yīng)具有劑量和時(shí)間的依賴性，這說(shuō)明HSC-3細(xì)胞的EMT水平隨TAE226的增加而下降。Kurio等[21]研究發(fā)現(xiàn)，TAE226可抑制FAK pTYr（397）和AKT pSer（473）的表達(dá)，TYr（397）是FAK最主要的自磷酸化位點(diǎn)。Jones等[22]發(fā)現(xiàn)，磷酸化后的Tyr397通過(guò)與Src的SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合，進(jìn)而激活下游PI3K/Akt通路，而后者激活后可以參與誘導(dǎo)細(xì)胞EMT的發(fā)生，且經(jīng)TAE226處理后的OSCC細(xì)胞，其黏附喪失速度下降，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相符，TAE226可能通過(guò)下調(diào)FAK pTYr（397）的表達(dá)而抑制HSC-3細(xì)胞EMT進(jìn)程的。

綜上，TAE226作為FAK的強(qiáng)效抑制劑之一，能有效抑制OSCC細(xì)胞EMT過(guò)程，從而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，但具體分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。單獨(dú)使用TAE226或與其他藥物聯(lián)合使用可有望成為治療OSCC的一種有效方法，為進(jìn)一步探索口腔腫瘤的防治策略提供參考。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。