組織來源不同的間充質干細胞生物學特性及COPD 治療的研究進展

周斌林，熊麗嬌 綜述；曾治平* 審校

（1.江西省贛南醫學院，贛州 341000；2.江西省贛南醫學院第一附屬醫院全科醫學科，贛州 341000）

慢性阻塞性疾病 (chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是普遍存在、可及時預防、及時治療的呼吸系統慢性疾病,是以小氣道結構和（或）肺泡異常引起持續性氣流受限并進行性加重為主要特征[1]。 現慢性阻塞性肺疾病已逐漸成為了重要的公共衛生安全問題,根據GBD（全球疾病負擔）研究,從1990 年到2013 年,COPD 從全球疾病負擔的第八位上升到第五位[2]，且相關數據統計,僅在2017 年,COPD 在中國和美國地區造成1135.2 萬死亡人數,占當年全球COPD 死亡總人數的三分之一[3]。COPD 的發病率及死亡率因持續暴露于COP D 危險因素及全球社會人口結構改變正逐步升高，預計到2020 年將上升為全球致死疾病的第三位[4]。 目前COPD 嚴重危害人類健康，雖采用現有的各種治療措施如家庭氧療、糖皮質激素、支氣管擴張劑等治療措施可有效緩解氣道炎癥,提高生活質量, 但并不能有效預防疾病進展或修復肺結構/肺功能[5]。 隨著對間充質干細胞（mesenchymal stem cells, MSC） 研究的不斷深入，MSCs 已成為當前治療慢性阻塞性肺疾病一種潛在新的有效治療手段。 不同組織來源的MSC 的增值、分化、免疫表型及免疫調節活性等生物學特性在多方面不僅存在差異，而且對患者治療效果有影響。 現主要將探討骨髓、脂肪、臍帶等不同組織來源的MSCs 生物學特性的差異及治療COPD 的相關研究進展。

1 間充質干細胞

間充質干細胞是來源于不同的受體組織或不同器官的一種多能干細胞，如脂肪細胞、骨髓、臍帶血及羊水， 而且具有分化為不同中胚層細胞譜系的特性[6]。 國際細胞治療學會和組織干細胞委員會根據三個基本標準化來定義間充質干細胞：⑴在一個標準化的培養基中充分黏附于塑料表面，⑵充分表達CD105、CD73、CD90 細胞表面標志物，缺乏對造血細胞表面標志物CD34、CD45、CD79a、CD14、CD11b、CD19、CD11a 和 HLA-DR Ⅱ類分子的表達，⑶在體外可多向分化為骨細胞、脂肪組織細胞、軟骨組織細胞的能力[7,8]。 多項研究成果表明MSCs 不僅具有自我更新及向其它組織分化的能力，還對多種先天性或適應性免疫細胞具有免疫調節作用，如可以抑制樹突狀細胞（DC）的自我分化及成熟、促進巨噬細胞向M2 型細胞極化、抑制自然殺傷細胞 （NK）、NKT 細胞、B 細胞、CDT 性細胞增殖及誘導 Treg 性 T 細胞擴增等[8-11]。 MSCs 的免疫調節作用主要是通過多種可溶性介質的釋放經旁分泌途徑參與[12,13]。 此外，Huaman 等[14]研究中發現MSCs 缺乏表面組織相容性復合體I 和II 及T細胞表面共刺激分子（CD40、CD80 及 CD86）的表達導致MSCs 免疫源性較低，可有效逃避免疫排斥反應。這些特性使得MSCs 成為包括慢性阻塞性肺疾病在內的多種疾病理想的治療細胞類型。

2 組織來源不同的間充質干細胞生物學特性差異

2.1 分離和增殖 骨髓組織是分離多能MSCs 的主要組織來源并被廣泛應用于基礎及臨床研究。骨髓間充質干細胞 (bone marrow-mesenchymal stem cells, BM-MSCs）的分離是一種創傷性相對較高的過程，在Turinetto 等[15]研究中發現骨髓來源的間充質干細胞的數量、壽命、分化及增值潛能與個體年齡呈負相關。 臍帶間充質干細胞（Umbilical cord -mesenchymal stem cells, UC-MSCs） 和脂肪間充質干 細 胞 （Adipose-derived -mesenchymal stromal cells, ASCs）可通過創傷較小、規模大、更安全的方法分離，在 Seo 等[16]和 Vanpham 等[17]研究中發現脂肪和臍帶組織來源的間充質干細胞可在長時間內維持其生物學特性。 UC-MSCs 和ASCs 有望成為MSCs 的替代組織來源。 組織來源不同的間充質干細胞在體外均可增殖培養， 但體外增值培養仍有差異。 Chen 等[18]在間充質干細胞體外增殖培養研究中發現UC-MSCs 增殖培養能力最強， 但Nakao等[19]研究中發現BM-MSCs 增殖培養能力最高，而ASCs 與 BM-MSCs 和 UC-MSCs 相比，ASCs 增殖能力相對較弱。 間充質干細胞體外增值能力不同可能與不同細胞傳代數或起源組織內的增殖力不同有關。

2.2 免疫表型 組織來源不同的間充質干細胞均可表達典型間充質干細胞的免疫表型， 但不同組織來源的間充質干細胞免疫表型具有差異。 骨髓間充質干細胞高度表達 CD49f （整合素 a6）和PODXL，而 ASCs 對 CD34 表達水平較高，且其他組織來源的間充質干細胞表達較低的CD34，并且ASCs 高度表達 CD49d(整合素 a4)、CD54(ICAM-1)[20]。 Chu 等[21]研究中發現免疫表型 CD36+/CD106-對骨髓間充質干細胞和脂肪間充質干細胞有一定鑒別作用。 此外，不同組織來源的MSCs 的免疫原性表達程度水平不同。Alhattab 等[22]研究表明BMMSCs 的 HLA-DR 和 HLA-DBQ2 類及 HLA-C 類MHC 分子表達最高。 Huaman 等[14]研究中發現 AS Cs 與 BM-MSCs 相比,ASCs MHC-I 和 MHC-II 基因和蛋白表達水平較低，提示ASCs 具有較低的免疫原性。 此外，Ma 等[23]研究中發現 UC-MSCs 同樣具有較低的免疫原性。 這意味著骨髓間充質干細胞易引起適應性免疫應答， 不利于同種異體細胞移植及存活。

2.3 細胞因子 現有的研究表明間充質干細胞主要是通過多種可溶性介質的釋放經旁分泌作用發揮免疫調節作用。 大量實驗數據已表明不同組織來源的間充質干細胞分泌的可溶性介質不同。Ostanin 等[24]在分析不同組織來源的MSC 分泌可溶性介質的研究中發現BM-MSC 自發性產生可溶性介質的水平較低，ASCs 自發性分泌更多的IFN-γ,IL-2,IL-1β,TNF-α,IL-4,IL-6,G-CSF,GM-CSF 和趨化因子,ASCs 表現為顯著的促炎、免疫調劑和刺激造血功能, 但在LPS 刺激下BM-MSC 分泌可溶性介質明顯增加，ASCs 分泌水平無明顯提高。有研究發現骨髓間充質干細胞分泌較高的IL-6、IL-10、TGF-β1、PGE、VEGF[19,25]。Dabrowski 等[26]研究中發現臍帶間充質干細胞比ASCs 分泌較高的TGF-β 和較低的 VEGF, 而 IL-6、IL-10、TNF-α、MMP-1、MMP-13 等細胞因子分泌水平兩者無明顯差異。此外，細胞因子分泌與免疫相關基因表達有關，不同組織來源的MSC 免疫相關基因表達也有差異[10,11,22]。

2.4 免疫調節活性 大量研究表明間充質干細胞在體內或體外均可對多種先天性和適應性細胞發揮免疫調節作用，但不同組織來源的MSCs 對免疫細胞調節能力存在差異。 Ribeiro[27]等研究發現脂肪、骨髓、臍帶三種組織來源的MSC 在與PHA 刺激的單核細胞共培養時，三者均可有效抑制CD4、CD8T 細胞活化及對淋巴母細胞特征的獲取，其中ASCs 抑制作用更明顯，而與BM-MSCs 和ASCs 相比較，UC-MSCs 對B 細胞的活化及CD56NK 細胞的活化激活無明顯抑制影響。 Valencia 等[28]對來自同一供體的BM-MSCs 和ASCs 在與NK 細胞共培養研究中發現兩者對NK 細胞的增殖、細胞因子分泌、 活化受體及細胞毒性的免疫調節作用兩者之間無明顯差異，但ASCs 抑制樹突狀細胞分化的能力更強。 此外，另一項研究表明BM-MSCs 和UCMSCs 可促進巨噬細胞向抗炎表型（M2 型）極化，而ASCs 對促進巨噬細胞極化無明顯調節作用[29]。Deng 等[30]研究中發現臍帶間充質干細胞還可通過分泌IL-6、HGF 誘導單核細胞向低表達共刺激分子CD14+CD1a-細胞分化，且該誘導單核細胞顯著表達IL-10。 間充質干細胞的免疫調節活性還與細胞傳代數有關。 ElSayed 等[11]研究中發現骨髓間充質干細胞與巨噬細胞共培養中，BM-MSCs 早期傳代細胞促進巨噬細胞M2(抗炎)表型轉化，而晚期傳代細胞則促進向M1（促炎）表型轉化，且晚期傳代細胞對CD4、CD8T 細胞增殖抑制作用減弱。Zhuang 等[31]研究中發現衰老的UC-MSCs 比骨髓間充質干細胞表現出更強的免疫抑制活性， 這可能與衰老的 UC-MSCs 中 HMOX-1、IL-10、IL-6 和誘導型一氧化氮合酶（iNOS）等免疫抑制基因上調有關。

3 MSCs在COPD治療中的研究進展

大量基礎研究及臨床前研究表明間充質干細胞具有免疫調節、 促血管生成及促組織再生修復等生物學特性，并在移植物抗宿主病[32]、系統性紅斑狼瘡[33]、視網膜病[34]等疾病研究中取得令人鼓舞的結果。 間充質干細胞治療COPD 在臨床前肺氣腫小鼠模型研究中被證實有效。 WenGu 等[35]在骨髓間充質干細胞治療香煙誘導的肺氣腫小鼠模型中發現與對照組相比，BM-MSCs 處理的肺氣腫小鼠肺組織病理顯示炎癥浸潤及肺泡結構破壞明顯改善。 Kennelly 等[36]研究中發現 BM-MSCs 在彈性蛋白酶誘導的慢阻肺小鼠模型中同樣顯示MSC 治療后可減少肺泡損傷及肺內膠原基質堆積。 此外，Fukui 等[37]在彈性蛋白酶誘導的肺氣腫小鼠模型中證實ASCs 可分化為肺泡上皮細胞修復肺損傷及改善肺功能。

間充質干細胞進行了多項治療COPD 的臨床實驗。 Weiss 等[38]研究中納入了62 例中至重度的COPD 患者并接受了4 次MSC 輸注， 并在第一次輸注后隨訪2 年，結果顯示MSC 組27 名患者和安慰劑組28 名患者出現不良事件， 其中MSC 組10例，安慰劑組8 例發生嚴重不良事件，但大多數不良事件報告為輕度，在 FEV、FEV 預測值、FVC、肺活量等方面兩組無顯著統計學差異， 但MSC 組循環CRP 早期較基線水平下降。 Oliveira 等[39]研究中招募了10 例重度肺氣腫患者并分為EBV（單向支氣管瓣植入術）+MSC（實驗組）和EBV+生理鹽水（對照組），進行90 天的隨訪，在MSC 注射期間未觀察到嚴重或顯著的臨床癥狀及體征， 其中實驗組和對照組分別發生2 例和3 例不良事件， 兩組患者的肺功能 （如：FEV、FVC、FEV/FVC、TLC）、體重指數和6min 步行實驗結果顯示無明顯差異，但EVB+MSC 組循環 CRP 在第 30、90 天較基線水平顯著下降。 Stolk 等[40]研究中招募了10 名重度肺氣腫患者并進行2 次肺減容手術， 在第一次肺減容手術時分離BM-MSCs 并進行體外擴增，在第二次手術前3 周和4 周分別進行靜脈輸注BM-MSCs，并在最后一次BM-MSCs 輸注后3 周內進行評估，結果表示在輸注48 小時內及3 周內均未出現癥狀或毒性反應， 且該研究還采用免疫組化及PCR技術分析了兩次手術后的肺組織， 結果顯示經BM-MSCs 輸注后， 肺泡間隔的內皮標志物CD31的表達增加了 3 倍， 證明MSCs 可誘導 CD31 表達，而CD31 在內皮細胞遷移及血管生成中扮演重要角色，此外，隨訪1 年后，FEV 較基線增加了(390±240)ml，殘氣量減少了(540±145)ml，所有患者的體重平均增加了4.6kg， 其可能是肺減容術及間充質干細胞治療綜合作用的結果，然而，臨床上應用間充質干細胞治療COPD 是否可改善肺功能尚不明確，仍需進一步研究。 綜上所述，在COPD 患者進行多劑量間充質干細胞治療似乎是安全的、 可行的，并可減少炎癥反應，這些研究結果為臨床上應用間充質干細胞治療COPD 提供重要依據。

4 結論

現在大量研究表明間充質干細胞治療COPD是安全、可行的，但同時需要考慮不同組織來源的間充質干細胞在分離和增殖、 免疫表型、 細胞因子、免疫調節功能等生物學特性方面存在差異。 骨髓組織現為間充質干細胞提取的主要組織來源，但骨髓間充質干細胞提取創傷大，提取細胞數量、增殖能力受年齡影響， 其免疫調節能力與細胞傳代數有關。 脂肪和臍帶來源的間充質干細胞來源豐富，容易獲取，免疫原性相對較低，利于細胞移植及存活等優點，使其成為理想的替代組織來源，但是否適應體內的環境仍需要進一步研究。 因此我們可以根據不同來源的間充質干細胞的生物學特性差異，選擇性的服務于臨床，為今后臨床治療COPD 選取合適理想的種子細胞。