雙功能酶6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-雙磷酸酶4(PFKFB4)在腫瘤中的作用與研究進展

余朝軍 趙寧輝

為滿足惡性增殖對能量和營養物質的需求，腫瘤細胞在適應微環境、生存和增殖方面表現出異常的可塑性。腫瘤微環境中的癌細胞和其他細胞的代謝重編程滿足了這些要求，這對于腫瘤的生存和增殖是必不可少的。腫瘤細胞代謝重編程包括：葡萄糖以有氧酵解為主，氧化磷酸化減弱；磷酸戊糖代謝途徑增強、谷氨酰胺分解代謝活躍、脂代謝異常等諸多方面。代謝重編程涉及腫瘤微環境中癌基因、腫瘤抑制因子、生長因子和局部因素之間的復雜相互作用。這些因素可誘導間質細胞和腫瘤細胞中代謝酶系和代謝方式的改變，如與Warburg效應相適應的代謝酶系，葡萄糖轉運蛋白(GLUTs)及糖酵解限速酶如己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK)、乳酸脫氫酶A(LDHA)等關鍵酶的活性與蛋白質表達水平在腫瘤細胞中有著不同程度的上調[1]。這些酶系和代謝方式改變滿足了腫瘤細胞快速生長和增殖的需求，一方面彌補了糖酵解途徑產能低效的缺點并為細胞的合成代謝提供了豐富的底物；另一方面在腫瘤的轉移及免疫等方面發揮著重要作用。如糖酵解增強使乳酸大量生成并釋放到細胞外，而乳酸能夠作為能源底物直接參與三羧酸循環，幫助腫瘤細胞逃脫免疫傷害，促進腫瘤細胞的侵襲[2,3]。代謝酶6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶4(PFKFB4)被證明在膠質母細胞瘤、胃癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺小細胞神經內分泌癌(SCNC)等多種人類腫瘤中存在表達增加[4～10]。本文綜述了PFKFB4在腫瘤發生、發展和代謝中的作用及其調控與受控機制，并闡述了其在靶點治療中的研究進展。無論是直接針對該同工酶或間接抑制它的激活因子，都可能是治療惡性腫瘤一種很有前途的方法。

一、PFKFB4的結構與基因定位

6-磷酸果糖激酶-1 /果糖-1,6-二磷酸酶(PFK1/FBPase1)同工酶催化的果糖-6-磷酸/果糖-1,6-二磷酸(F-6-P/F-1,6-BP)循環在控制糖酵解速率方面起著關鍵作用，其活性受果糖-2,6-二磷酸(F-2,6-BP)調節[11]。雙功能酶家族6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶(PFK-2/FBPase-2，PFKFB)調節F-2,6-BP合成。PFKFB作為一個二聚體，包括兩個結構域：主要的α/β域和一小的結構域，目前的研究發現有PFKFB1～4 4種同工酶，分別由不同的基因PFKFB1～4編碼，所有同工酶均含有高度保守的核心結構，廣泛存在于各種生物細胞中，在體內4種同工酶均由缺氧誘導。因PFK-2和FBPase-2處于一條單一的多肽鏈上，所以其是一個雙重功能的酶，PFK-2催化F-6-P，在Mg2+與ATP的參與下合成F-2,6-BP，另一方面后者經FBPase-2催化又可降解產生F-6-P及磷酸。催化反應位點在該同型二聚體蛋白質的同一多肽鏈上發生，PFK-2催化的活性部位在該酶亞基的N末端區域，而FBPase-2則在C末端區域，其同工酶的一個特性在于PFK-2/FBPase-2活性比。

PFKFB4是雙功能酶PFKFB家族蛋白之一，在人類中由PFKFB4基因編碼，包含有14個外顯子和13個內含子，最初是從人睪丸cDNA文庫分離出來的PFK-2/FBPase-2同工酶基因，位于3號染色體，p21-p22區，開放閱讀框架長1410bp，編碼469個氨基酸，相對分子質量為54000[12]。既往認為，PFKFB4 同時具有激酶和磷酸酶活性的主要生物學功能，即合成(激酶/PFK-2) 和水解(磷酸酶/FBPase-2) 糖酵解信號分子F-2,6-BP，通過調控細胞內的糖酵解水平, 進而控制腫瘤的生長。目前越來越多的研究發現PFKFB4在多種腫瘤中的過表達還與腫瘤的發生、發展及某些腫瘤的預后相關，如PFKFB4高表達預示原發性膠質母細胞瘤和浸潤性膀胱癌患者預后不良[8]。

二、PFKFB4在腫瘤糖酵解中的調節作用

腫瘤細胞的糖酵解通量通過不同酶促反應的微調來進行，使葡萄糖衍生的碳單元能夠進入其他合成代謝途徑，如核苷酸和蛋白質的生物合成。PFKFB4由缺氧誘導，是缺氧誘導的糖酵解反應所必需的[4]。PFKFB4的相對激酶和磷酸酶活性可以適應腫瘤微環境不斷變化的需要。腫瘤細胞中的葡萄糖主要通過糖酵解或磷酸戊糖途徑被利用，所以將其分流到這兩種途徑中以平衡合成代謝和氧化還原穩態，是確保腫瘤無限增殖和逃避凋亡的關鍵。腫瘤細胞中PFKFB4最重要功能之一就是通過糖酵解的變構調節來調控糖酵解和磷酸戊糖途徑代謝通量。研究表明，PFKFB4將葡萄糖代謝中間體轉移到各種癌細胞的磷酸戊糖途徑(PPP)，在管理活性氧(ROS)積累方面發揮了關鍵作用[13～15]。

在前列腺癌中PFKFB4通過平衡糖酵解活性和抗氧化產物，維持細胞的氧化還原平衡[6]。一項兩種前列腺癌糖代謝差異的研究中發現，PFKFB4在良性前列腺組織中的表達低于腺癌，在小細胞神經內分泌癌(SCNC)中表達明顯高于腺癌，而SCNC比腺癌表現出更明顯的糖酵解效應[7,16]。CD44是糖代謝的關鍵調控因子，SCNC細胞的CD44敲除降低了PFKFB4的mRNA和蛋白水平及糖酵解作用。轉移性前列腺癌細胞中PFKFB4 mRNA的表達高于原發腫瘤，通過RNAi的無偏性篩選表明，PFKFB4基因敲除可阻斷前列腺癌細胞的生長，并引起前列腺癌異種移植瘤的消退，證實前列腺癌細胞依賴PFKFB4而生存[6]。進一步研究發現前列腺癌細胞中PFKFB4的下調是通過破壞PPP，導致ROS的積累和自噬誘導。

選擇性沉默PFKFB4增加了前列腺癌細胞中果糖-2,6-二磷酸的濃度，表明其在前列腺癌細胞中主要發揮磷酸酶作用，將葡萄糖-6-磷酸轉移到PPP。由此可見，PFKFB4通過減少前列腺癌細胞中果糖-2,6-二磷酸水平，使葡萄糖-6-磷酸導向PPP，降低了糖酵解途徑活性，使NADPH和谷胱甘肽水平升高，最終減少腫瘤細胞的氧化應激和死亡，避免前列腺癌細胞的凋亡，促進腫瘤的生長。p53缺陷的結腸癌中，癌細胞也高度依賴于PFKFB4同工酶的功能。對于p53缺失腫瘤細胞，PFKFB4維持著葡萄糖用于能量產生與抗氧化劑合成之間的平衡，是腫瘤細胞存活必需的[13]。p53缺失的癌細胞中PFKFB4缺失也會破壞PPP，導致細胞生物合成活性的破壞和ROS的增加。但在野生型p53細胞中沒有觀察到這種效應，也間接表明了p53調節PFKFB4的表達，并且p53缺陷的癌細胞高度依賴于該酶的功能。相反，在其他類型轉化細胞和腫瘤中PFKFB4的表達對于合成果糖-2,6-二磷酸又是腫瘤細胞糖代謝重新編程所必需的，所以對PFKFB4的酶活性和調節需要具體分析，以確定其作為FBPase-2的潛在作用[6,13]。

肺腺癌H460細胞中沉默PFKFB4降低了低氧誘導的糖酵解通量，抑制癌細胞在低氧條件下的增殖和存活[17]。肝細胞肝癌(HCC)中過氧化物酶增殖激活受體γ(pPARγ) 磷酸化可以直接激活PFKFB4的表達，從而增強HCC中葡萄糖的利用和糖酵解，促進細胞增殖[18]。腦膠質瘤干細胞(CSCs)中，PFKFB4的敲除降低了乳酸分泌和ATP水平，導致大量細胞死亡，表明PFKFB4對維持腦CSCs的干性可能至關重要[8]。

這些結果表明PFKFB4在腫瘤生長和進展中有著關鍵功能，但對于PFKFB4調控糖酵解和PPP通量的具體機制尚不完全明確。近年來一項乳腺癌研究中，Dasgupta等[15]研究發現PFKFB4磷酸化激活致癌轉錄因子SRC-3會導致轉酮酶的上調。這一發現解釋了一些腫瘤細胞中PFKFB4過表達對糖代謝的影響，如PPP的關鍵非氧化酶的轉錄以及糖酵解中間體向PPP非氧化性臂的重定向。

三、PFKFB4在腫瘤細胞中糖酵解以外的功能

隨著糖酵解研究的深入，發現糖酵解酶在各種生理或病理過程中還發揮了調控糖酵解以外的功能及作用[19]。近年來研究發現，除了公認的在有氧糖酵解，生物合成和氧化還原穩態中的作用外，PFKFB4還參與了轉錄調節、細胞周期進程、自噬和腫瘤轉移等過程。

近年來代謝酶研究的一個重大發現是一些代謝酶可作為蛋白激酶參與腫瘤的轉錄調控，例如丙酮酸激酶M2(PKM2)[20]。PKM2在Thr11磷酸化組蛋白H3調控基因轉錄。此外，PKM2還通過磷酸化許多非組蛋白，如Bub3，肌球蛋白輕鏈2和PAK2等，調節腫瘤的有絲分裂和細胞骨架等生物學過程。一項乳腺癌的研究揭示了PFKFB4作為蛋白激酶的新功能[15]。在乳腺實體惡性腫瘤中，PFKFB4表達明顯高于非惡性組織。PFKFB4被發現可作為蛋白激酶磷酸化致癌類固醇受體輔激活因子-3 (SRC-3)，增強其轉錄活性，以驅動乳腺癌進程。SRC-3是前列腺、乳腺和卵巢腫瘤為介導激素依賴性基因表達而激活的一種轉錄輔激活因子。通過抑制PFKFB4或磷酸化缺陷型突變體SRC-3的異位表達，可抑制SRC-3介導的轉錄。PFKFB4或SRC-3沉默抑制了乳腺腫瘤的生長和轉移。

研究表明PFKFB4通過從ATP轉移磷酸基團來磷酸化Ser857上SRC-3的CBP相互作用結構域，從而增加SRC-3活性。Ser857位點的磷酸化促進SRC-3與ATF4的結合，并募集到靶基因轉酮酶(TKT)，TKT介導了非氧化性PPP和嘌呤的合成。此外，SRC-3還上調腺苷一磷酸脫氨酶-1(AMPD1)和黃嘌呤脫氫酶(XDH)，它們直接或間接參與嘌呤合成代謝。PFKFB4或SRC-3的沉默不僅會減少細胞內核糖體-5p的數量，還降低了高糖酵解乳腺癌細胞中嘌呤核苷酸及腺苷，黃嘌呤和鳥嘌呤等中間代謝物的濃度。這些結果與前面研究證明的PFKFB4對于癌細胞PPP至關重要的結論一致。因此，PFKFB4可通過代謝和轉錄調控PPP途徑，促進葡萄糖的利用。此外，PFKFB4在Ser857上對SRC-3的磷酸化也在雌二醇和葡萄糖存在下促進了雌激素受體活性。由此證明PFKFB4通過刺激SRC-3促進腫瘤侵襲性和轉移性，將糖代謝與轉錄激活聯系起來。但Goncalves等[21]研究也指出PFKFB4作為蛋白激酶的新特性需要更多深入的研究來證實，因為尚不清楚PFKFB4是否直接磷酸化SRC-3，也可能是與PFKFB4結合的昆蟲蛋白激酶介導了SRC-3的磷酸化。另一項乳腺癌的研究發現，PFKFB4通過誘導透明質酸(HA)產生以p38依賴的方式促進乳腺癌轉移，在體內和體外實驗中PFKFB4都能增強乳腺癌細胞的遷移和侵襲性。進一步研究發現PFKFB4對遷移的影響主要是通過誘導透明質酸合酶2(HAS2)的表達上調和HA的產生來介導，而促進乳腺癌細胞的轉移。

為滿足生物合成的需要，有效的代謝適應需要主動自噬降解細胞質的含量。自噬受各種應激刺激的調節，包括營養缺乏，氧化應激和缺氧，并且還與耐藥性有關。由于PFKFB4在維持能量代謝和氧化還原穩態方面的作用，所以它可以在細胞環境中正向或負向調節自噬。PFKFB4的缺失降低了進入PPP的通量，破壞了NADPH的生成，增強ROS水平以誘導自噬[14]。p53缺失的結腸癌細胞中，PFKFB4的高磷酸酶活性使癌細胞免受過度氧化應激，PFKFB4缺失減弱了生物合成活性，使細胞生物合成活性破壞和ROS增加，導致細胞死亡[13]。一項小細胞肺癌(SCLC)細胞的研究發現，PFKFB4受內皮酪氨酸激酶(Etk)的正向調控，并可與Etk直接結合。SCLC細胞中Etk或PFKFB4的缺失降低了自噬活性。相反，PFKFB4的高表達增加了化療耐藥，并且與SCLC患者較差的化療反應及預后相關。但其PFKFB4調控自噬的機制尚不完全清楚，需要進一步研究Etk與PFKFB4之間的相互作用是如何調控耐藥性SCLC細胞的自噬誘導。有研究發現p62蛋白的積累與腫瘤細胞自噬有關。在前列腺癌細胞中觀察到若抑制PFKFB4可引起p62和ROS積累，增加了自噬通量[14]。抗氧化劑和PFKFB4的聯合抑制阻止了p62的積累，從而避免了自噬。因此，PFKFB4表達是這些細胞中ROS解毒所必需的，沒有它作為ROS的解毒反應可能刺激自噬。

四、PFKFB4受多種因素的調節

目前普遍認為，調節PFKFB4基因表達的因素是腫瘤低氧微環境下缺氧誘導因子1α(HIF-1α)的調控機制[5,8]。在幾種乳腺癌細胞系中，缺氧環境下PFKFB4的表達均增加，并證實其由HIF-1α誘導。對于缺氧誘導PFKFB4表達的機制，Minchenko首先發現了缺氧誘導PFKFB4基因表達是由缺氧反應元件(HRE)介導的，HIF-1α與PFKFB4基因5′-啟動子區的HRE結合，從而誘導PFKFB4基因的轉錄。隨后Zhang等在膀胱癌的研究中，從PFKFB4啟動子區域的5個HRE缺氧反應元件中篩選出HRE-D，并證明了HRE-D在膀胱癌細胞中被HIF-1α反式激活。哺乳動物雷帕霉素受體蛋白(mTOR)信號通路的激活也以HIF-1α依賴性方式上調PFKFB4轉錄。

此外，PFKFB4還受myc過度表達，ras激活和p53功能喪失等多種致癌及抑癌信號通路的轉錄調控。例如，PFKFB4的啟動子有p53反應元件，基因的轉錄會直接受到野生型p53的抑制[13]。p53與啟動子結合，通過組蛋白去乙酰化酶介導轉錄抑制，從而降低PFKFB4基因的表達。另外，在前列腺小細胞神經內分泌癌細胞中發現PFKFB4受到CD44的正向調控[16]。

五、以PFKFB4作為腫瘤治療策略的研究進展

與正常細胞比較，癌細胞必須保持較高的糖酵解速率，特別是對線粒體呼吸功能缺陷細胞，同時腫瘤細胞糖酵解的增強常與耐藥性相關，因此抑制腫瘤細胞糖酵解成為殺死癌細胞和克服耐藥性的有效方法。PFKFB4是許多腫瘤中主要的過表達PFK2同工酶，將其作為治療靶點的潛在應用受到越來越多關注。

研究證明，來自不同組織起源和遺傳背景的腫瘤細胞均需要PFKFB4表達，PFKFB4是導致PFK-1活化的調節酶，是限速酶和糖酵解途徑中的關鍵控制點。Chesney等[22]研究發現，用于抑制PFKFB4酶的試劑可能有助于降低腫瘤代謝和生長。研究人員使用基于結構的虛擬計算篩選，鑒定研制出小分子PFKFB4抑制劑5-(n-(8-甲氧基-4-喹啉基)氨基)戊酸硝酸酯(5MPN)。在臨床前小鼠模型中顯示出有效的抗腫瘤作用和較高的口服生物利用度。口服給藥后顯著降低小鼠模型中已建立的Lewis肺癌移植瘤的生長，并確定5MPN是通過競爭性地結合PFKFB4的F-6-P結合位點，抑制其激酶活性，降低細胞內F-2,6-BP，糖酵解和ATP含量，進而抑制肺腺癌細胞增殖。此外，5MPN還可在不影響正常支氣管上皮細胞的情況下，選擇性抑制Ras轉化支氣管上皮細胞的細胞增殖和腫瘤生長。

然而，以PFKFB4作為腫瘤治療策略還有許多問題需要研究。例如，PFKFB4具有較高的FBPase-2活性，使葡萄糖向戊糖磷酸途徑重定向，為脂類生物合成和清除活性氧提供了還原能力，對維持氧化還原平衡和促進前列腺癌細胞存活至關重要[6]。但目前尚未開發出選擇性抑制FBPase-2活性的治療策略；其次，PFKFB4被證明可作為蛋白激酶促進腫瘤的侵襲、轉移，但還不清楚能否在不影響其激酶活性的情況下開發出針對PFKFB4蛋白激酶活性的特異性抑制劑，在腫瘤進展期間各種微環境條件下控制PFKFB4活性。

六、展 望

腫瘤細胞的糖酵解是一種復雜、動態的過程，在該過程中糖酵解和其他代謝途徑被重新編程，以增加細胞增殖所需的能量生產和生物分子合成。了解糖酵解酶在腫瘤細胞和其他細胞中的調控與受控機制，對癌癥的診斷和預后以及開發更多選擇性治療具有重要意義。同時，由于腫瘤細胞代謝重編程的復雜性，糖酵解的藥理學作用也尚未被證明臨床有效。

PFKFB4在多種腫瘤細胞中過表達，參與調節腫瘤細胞的糖酵解通量、轉錄調節、細胞周期進程、自噬和腫瘤轉移等過程，且可作為某些腫瘤的預后標志物，有較高的研究價值。本文總結了目前關于PFKFB4及其在腫瘤中的作用，并介紹了與其相關的調節機制及將其作為靶點治療的研究進展。但現有研究仍缺乏更多對其潛在分子機制的探索，多為一些與臨床病理特征相關性的研究，對將其作為療效指標的研究更為少見。PFKFB4的小分子抑制劑與其他藥物組合已被證明可以提高癌癥治療效率，但有關PFKFB4抑制劑的臨床前數據還需要進一步確認其潛在的臨床應用價值。因此針對PFKFB4仍有待于開展深入地研究，為其成為腫瘤治療的靶點提供更多理論和實驗依據。