外泌體與肺纖維化相關的研究進展

劉永駿，李婷，董昭興

(昆明醫科大學第二附屬醫院呼吸與危重癥醫學科，昆明 650101)

肺纖維化是嚴重影響人類呼吸功能的疾病，其發病機制為各種原因所致肺泡上皮細胞的反復損傷、應激、凋亡，成纖維細胞發生上皮-間充質轉化激活，肺基質逐漸破壞，導致肌成纖維細胞的活化和積累，同時肺泡上皮細胞不能進行正常的修復重建，最終導致肺纖維化的發生[1]。目前，尚無特效的肺纖維化治療藥物，特發性纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)確診患者的平均生存周期僅3～5年[2]。新型抗纖維化藥物(吡非尼酮和尼達尼布)可減緩患者用力肺活量的下降，但不能控制肺纖維化的進展，也不能逆轉現有的肺纖維化[3]。

外泌體是由內體膜向內凹陷形成的直徑為30～150 nm的細胞微囊泡，外泌體與質膜融合后釋放到細胞外空間[4]。20世紀80年代后期，細胞外有外泌體存在被確定[5]。研究發現，外泌體是一種參與細胞間通訊的功能性載體[6]。外泌體廣泛存在于體液中，包括血液、尿液、唾液、羊水、支氣管肺泡灌洗液、母乳等[7]，可在心臟[8]、腎臟[9]、腹膜[10]等器官纖維化的發生過程及調節機制中起重要作用。現就外泌體與肺纖維化的關系予以綜述。

1 外泌體概述

細胞外囊泡(extracellular vesicles，EV)是由細胞分化、活化、衰老、轉化等多種刺激誘導的一種膜囊泡，包括外泌體、凋亡小體、微囊泡，而外泌體是唯一已知的源自內膜的分泌細胞囊泡，是由多泡體向胞內出芽產生靶向質膜的腔內囊泡，其過程目前尚未完全清楚，可能與轉運所需的內體分選復合物途徑、神經酰胺依賴性途徑有關[4,6]。

外泌體由脂質雙層膜形成，其中包含蛋白質、核酸和脂質及其衍生物等。外泌體所含蛋白質包括腔內蛋白質和跨膜蛋白，如熱激蛋白、四跨膜蛋白等，其中四跨膜蛋白，特別是白細胞分化抗原63和白細胞分化抗原81是常用的特異性外泌體標志物[4,6,11]。外泌體中含有的核酸包括信使RNA、微RNA(microRNA，miRNA)以及長非編碼RNA、環狀RNA、循環DNA、線粒體DNA，在人血漿來源的外泌體RNA中miRNAs最豐富。研究表明，外泌體中的核酸參與了許多疾病過程，如腫瘤、心血管疾病、自身免疫疾病等[6,12]。外泌體富含的脂質主要包括膽固醇、鞘糖脂、鞘磷脂、磷脂酰絲氨酸、花生四烯酸和其他脂肪酸、前列腺素和白三烯等，這些脂質不僅參與構成外泌體，還參與細胞生理病理過程[6,12-13]。研究認為，通過細胞-細胞接觸與鄰近細胞通訊是外泌體的最主要作用，外泌體可通過分泌的可溶性因子(如激素、細胞因子)與遠處細胞通訊，還可通過電子、化學信號(如核苷酸、脂質和短肽)參與信號轉導；此外，外泌體對維持組織細胞功能和調節細胞內環境穩態均起到關鍵作用，并可調節免疫細胞功能，從而介導免疫反應[6-7]。

根據外泌體大小、形態、浮選密度和標記蛋白的不同，外泌體的分離方法亦不同。外泌體常通過差速離心、尺寸排阻色譜、免疫親和捕獲、商用試劑盒或微流體技術從條件培養基或體液中分離獲得[6,13]。目前認為超速離心法是純化外泌體的最佳方法，可獲得高純度外泌體。實驗常用的商用試劑盒一般基于大小尺寸沉淀的方法，可大幅度縮短外泌體分離的操作時間，具有高效、可靠、可重復的優點；免疫親和捕獲產量很低，但特異性較高[6,11]。納米微流體是一種分離外泌體的新技術，具有分離速度快、純度高和回收率高的特點，應用潛力巨大[14-15]。熒光細胞激活分選、電子顯微鏡、流式細胞儀、液相色譜質譜以及Western印跡法是實驗室檢測外泌體的常用方法。動態光散射和納米粒子跟蹤分析技術具有快速、可靠、半定量的特點，但無法通過特定大小的顆粒識別外泌體的種類。利用表面等離子體共振與對細胞外結構域外泌體膜蛋白的特異性抗體進行微陣列分析的組合定量檢測和表征腫瘤來源的外泌體時，不需要富集或純化，為檢測、表征外泌體提供了簡便有效的新方法[6,16-17]。目前分離和純化外泌體的方法仍存在許多缺點和不足，仍需進一步的研究，以促進其臨床應用。

2 外泌體在肺纖維化中的作用

外泌體與多種纖維化疾病相關，包括腎纖維化[18]、心臟纖維化[19]、肝纖維化[20]等。攜帶特定物質的外泌體不但參與了器官纖維化的發病機制，還可作為血液、尿液等體液的纖維化生物標志物，為疾病診斷提供依據[18-20]。干預外泌體攜帶物質以及使用干細胞衍生外泌體已成為治療纖維化疾病的新手段[21-22]。外泌體對肺纖維化的作用，取決于其中所含物質的種類。

2.1外泌體中核酸在肺纖維化中的作用 目前，對外泌體中與肺纖維化相關核酸的研究主要集中于miRNA，含有miRNA的外泌體通過表面蛋白以配體-受體方式與細胞作用，根據外泌體所含miRNA種類的不同，對肺纖維化產生的影響不同[23]。Makiguchi等[24]對小鼠模型的研究發現，急性炎癥期(第7天)和慢性纖維化期(第28天)模型小鼠血清EV miR-21-5p水平均升高；該研究進一步監測不同血清EV miR-21-5p水平IPF患者肺活量6個月并隨訪30個月發現，血清EV miR-21-5p水平較高IPF患者短期內肺活量下降明顯，疾病進展較快，長期死亡率明顯高于miR-21-5p水平較低IPF患者，故認為血清EV miR-21-5p可作為IPF疾病進展和死亡預測的生物標志物。Liu等[25]的研究發現，博來霉素誘導的纖維化小鼠以及IPF患者的肺組織miR-21水平上調，證實miR-21在肺纖維化中具有重要作用。劉理靜等[26]發現，miR-21通過抑制血小板反應蛋白1型基因表達促進1型膠原蛋白和3型膠原蛋白合成，進而促進肺纖維化的發生。miR-21的外泌體參與并促進了肺纖維化的發生，且血清miR-21水平可作為判斷IPF患者預后的指標。

Njock等[27]通過檢測比較IPF患者與健康人群痰液中外泌體miRNA種類及含量的研究發現，miR-142-3p、miR-33a-5p、let-7d-5p三種miRNA與IPF密切相關；通過對肺部一氧化碳擴散能力/肺泡體積比的評估發現，miR-142-3p表達與肺功能呈負相關，并可通過Wnt信號通路促進間充質祖細胞正常增殖，miR-142-3p水平升高可能導致間充質細胞增殖和分化之間的平衡改變。另有研究報道，miR-142-3p過表達可能通過調節環加氧酶-2的表達和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路保護博萊霉素誘導的MLE-12小鼠肺泡上皮細胞損傷，推測含miR-142-3p的外泌體可能具有減輕肺纖維化的作用[28]。而let-7d-5p與miR-142-3p的作用完全相反，let-7d-5p下調可促進肺上皮細胞的上皮-間充質轉化，從而參與IPF的病理生理過程[27]。另有報道稱，miR-33a可以通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B途徑促進肝纖維化的形成[29]。由此可見，痰液中攜帶miRNA的外泌體參與了IPF的發病機制，可作為IPF診斷的生物標志物。Yao等[30]研究發現，肺纖維化大鼠模型miR-328的表達上調，且參與抗炎作用的M2型巨噬細胞分泌的含有miR-328的外泌體可靶向作用于FAM13A基因并下調其表達，刺激肺間質成纖維細胞的增殖。由此可見，肺纖維化患者或肺纖維化動物模型外泌體的miRNA種類及含量均發生了變化，提示含有miRNA的外泌體參與并調控IPF疾病的發生。

2.2外泌體中蛋白質在肺纖維化中的作用 外泌體中的蛋白質包括跨膜蛋白和內含蛋白，其中內含蛋白在肺纖維化過程中起重要作用。內皮細胞通過外泌體的非經典途徑分泌熱激蛋白70[31]。與野生型小鼠相比，熱激蛋白70過表達可改善轉基因小鼠博來霉素誘導的肺損傷和炎癥反應，抑制肺纖維化和肺功能障礙，且轉化生長因子-β1和促炎細胞因子的表達水平較低[32]。

Wnt信號通路是由配體Wnt蛋白和膜蛋白受體結合激發的一組多下游通道信號轉導途徑，是器官和組織發育的必需途徑，也是導致各種器官纖維化的主要原因之一[33]。Dziao等[34]的研究發現，小鼠成纖維細胞可分泌含有Wnt3a和Wnt5a的外泌體，Wnt3a可特異性地激活成纖維細胞的Wnt/β聯蛋白途徑，與轉化生長因子-β共同作用，增強成纖維細胞的促纖維化反應。但含有Wnt5a外泌體不依賴β聯蛋白發揮作用，而是通過激活蛋白激酶1/2和激活子蛋白1的非經典途徑，誘導促纖維化的白細胞介素-6的產生。有研究發現，IPF急性發作患者白細胞介素-6水平顯著升高[35]。Marin-Medina等[36]研究發現，Wnt5a在IPF患者和肺纖維化小鼠模型肺泡灌洗液EV中上調，而肺成纖維細胞是Wnt5a EV的主要來源。對原代肺成纖維細胞的研究發現，原代肺成纖維細胞衍生的EV或IPF支氣管肺泡灌洗液中的EV均可以通過內含的Wnt5a誘導原代肺成纖維細胞的增殖，但不能誘導成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化[37]。

除蛋白質外，外泌體還含有蛋白酶。蛋白酶/抗蛋白酶失衡是許多慢性肺病的標志，其中蛋白酶靶向細胞外基質組分以降解、破壞組織結構，并釋放細胞外基質衍生的生物活性信號，導致炎癥持續存在。Szul等[38]報道了一種調節人類肺部疾病中的慢性中性粒細胞炎癥反應至關重要的蛋白酶——脯氨酰肽鏈內切酶，脯氨酰肽鏈內切酶可裂解膠原片段并釋放一種重要的中性粒細胞趨化劑——三氨基酸序列脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸，可見脯氨酰肽鏈內切酶存在于人類氣道上皮細胞，由外泌體釋放并受模式識別受體Toll樣受體4的調節。另有研究發現，中性粒細胞趨化因子脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸以及受香煙煙霧成分刺激乙酰化的脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸具有抗纖維化的作用，并分別在白三烯A4水解酶和血管緊張素的作用下降解，故含有脯氨酰肽鏈內切酶的外泌體可能減少肺纖維化的發生[39]。由此可見，外泌體中不同的內含蛋白可通過不同途徑直接或間接促進或抑制肺纖維化。

2.3外泌體中脂質及其衍生物在肺纖維化中的作用 肺間質成纖維細胞分化為可收縮的肌成纖維細胞，并增殖和分泌過多的細胞外基質是肺纖維化發病機制的關鍵，而某些脂質信號分子(如前列腺素)可抑制肌成纖維細胞的分化。研究發現，促炎細胞因子白細胞介素-1β作用于原代人肺成纖維細胞可誘導環加氧酶-2表達，并產生含有前列腺素E2的EV，EV通過抑制轉化生長因子-β誘導的肌成纖維細胞分化和細胞外基質產生而發揮抗肺纖維化作用；此外，以上源自肺成纖維細胞的EV還可通過自分泌與旁分泌作用傳遞抗纖維化信號，在一定程度上證實了活化的成纖維細胞對附近幼稚成纖維細胞存在顯著抗纖維化作用[40-41]。既往研究表明，花生四烯類代謝物白三烯是肺纖維化的重要調控因子，且IPF患者支氣管肺泡灌洗液和肺組織中白三烯B4水平升高[42-43]。Majumdar等[44]研究發現，在中性粒細胞趨化過程中，白三烯B4在細胞多囊泡中以外泌體方式分泌，可見含有白三烯B4外泌體與肺纖維化的形成密切相關。

3 干細胞源性外泌體對肺纖維化的作用

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是存在于中胚層組織中的多能干細胞，可從骨髓、脂肪組織、血液、胎盤和臍帶等各種組織及器官中分離。Willis等[45]的研究表明，MSCs衍生的外泌體可改善肺形態和發育，減少肺的纖維化，改善肺血管重塑。Tan等[46]對人羊膜上皮細胞衍生的外泌體與人肺成纖維細胞所衍生的外泌體進行比較發現，人羊膜上皮細胞衍生的外泌體富含更多的與細胞凋亡、細胞發育生長、促分裂原活化的蛋白激酶、炎癥、表皮生長因子、血小板衍生生長因子、成纖維細胞生長因子相關通路的蛋白質，可靶向磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路、促分裂原活化的蛋白激酶途徑、Ras蛋白途徑、Hippo蛋白激酶途徑、轉化生長因子-β、黏著斑信號轉導通路等纖維化相關信號轉導途徑的miRNA，發揮抗炎、抗纖維化、促進小鼠支氣管干細胞再生的作用。Fujita等[47]發現，MSCs衍生的EV通過抑制炎癥反應、減少氧化應激改善各種肺部炎性疾病所造成的肺組織重塑和纖維化。Shentu等[48]研究證明，MSCs衍生的EV通過胸腺細胞表面糖蛋白1與整聯蛋白β相互作用后促進成纖維細胞對MSCs衍生的EV攝取，進而抑制轉化生長因子-β1誘導的肺成纖維細胞中α平滑肌激動蛋白的表達，降低纖維粘連蛋白和膠原蛋白Ⅲ的表達，抑制肺成纖維化細胞向肌成細胞分化，從而減輕肺纖維化。將MSCs衍生的外泌體作為肺纖維化的治療方案是目前的研究熱點，但MSCs衍生外泌體發揮抗肺纖維化的機制尚不完全清楚，仍需進一步探索。

4 小 結

外泌體作為一種攜帶核酸、脂質、蛋白質等物質的功能性載體，在肺纖維化發生和進展過程中起重要作用。攜帶某一特定物質的外泌體可促進肺纖維化的發生，而攜帶另一些特定物質的外泌體又能發揮抗肺纖維化的作用。外泌體的相關研究有助于解釋肺纖維化的發病機制以及調控肺纖維化的疾病進展。目前，對外泌體的認識十分有限，隨著研究的不斷深入，與肺纖維化相關的外泌體內含物及作用機制將逐漸被揭示。未來外泌體將有望成為臨床診斷、治療肺纖維化的重要手段。