定量蛋白組學(xué)技術(shù)在篩選急性主動脈夾層早期診斷標(biāo)志物中的研究進(jìn)展

買吐地·買吐遜，馬翔

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院冠心病二科，烏魯木齊 830054)

急性主動脈夾層(acute aortic dissection，AAD)是一種發(fā)病急、進(jìn)展快、病死率高、嚴(yán)重危及生命的急危癥，在急性發(fā)病后24 h內(nèi)，每小時死亡風(fēng)險增加1%[1]。盡早準(zhǔn)確診斷并及時采取適當(dāng)?shù)闹委煷胧┛娠@著降低AAD的病死率，改善遠(yuǎn)期預(yù)后，但由于AAD癥狀、體征復(fù)雜多變，往往很難與急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)、肺栓塞、急腹癥等疾病早期鑒別[2]。目前AAD主要依靠C反應(yīng)蛋白、D-二聚體、全主動脈CT血管造影(computed tomography angiography，CTA)及主動脈數(shù)字減影血管造影(digital subtraction angiography，DSA)等檢查診斷。其中CTA和DSA是目前AAD診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但DSA耗時長，有一定的創(chuàng)傷性，因此不作為AAD的常規(guī)檢查手段。由于無創(chuàng)、診斷準(zhǔn)確率高等優(yōu)點，主動脈CTA一般作為AAD首選檢查手段，但該檢查耗時也較長，可能延誤病情，故不適用于病情不穩(wěn)定的AAD患者[3]。由于缺乏靈敏度、特異度高的早期診斷標(biāo)志物，AAD快速診斷困難，因此篩選用于臨床的早期診斷AAD診斷標(biāo)志物，對防止患者病情進(jìn)展具有重要意義[4-5]。蛋白組學(xué)是蛋白質(zhì)與基因組學(xué)的結(jié)合，對基因組表達(dá)的絕大多數(shù)蛋白質(zhì)進(jìn)行精確的定量和鑒定，目前該技術(shù)主要常規(guī)用于發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物的研究中[6]。定量蛋白組學(xué)是蛋白組學(xué)技術(shù)的重要分支，被用來定量和識別基因組或復(fù)雜混合物中表達(dá)的所有蛋白質(zhì)[7-8]。現(xiàn)就定量蛋白組學(xué)技術(shù)在篩選AAD早期診斷生物標(biāo)志物中的應(yīng)用價值予以綜述。

1 定量蛋白組學(xué)技術(shù)的分類

1.1同位素標(biāo)記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)技術(shù) iTRAQ技術(shù)是由美國ABI公司研發(fā)的多肽體外標(biāo)記定量蛋白組學(xué)技術(shù)，該技術(shù)樣本兼容性好，既可相對定量也可絕對定量，可同時對8組樣本進(jìn)行定性、定量比較，具有蛋白通量高、覆蓋度高、自動化程度高等優(yōu)點[9]。用于臨床研究15年來，iTRAQ技術(shù)在國內(nèi)外深受歡迎，目前應(yīng)用iTRAQ試劑對血清、血漿、組織等樣本進(jìn)行高通量的液相二級質(zhì)譜分析，獲得一些對疾病有早期診斷價值的候選生物標(biāo)志物，可為主動脈夾層、肝癌、前列腺癌、肺癌及乳腺癌等疾病的早期診斷、預(yù)后評估提供很大的幫助[10-11]。

1.2串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽(tandem mass tag，TMT)技術(shù) TMT標(biāo)記是一種采用6-plex或10-plex同位素的標(biāo)簽進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析的多肽體外標(biāo)記蛋白組學(xué)技術(shù)。TMT技術(shù)能同時比較2組、6組或10組不同樣品中蛋白質(zhì)的相對含量，具有較好的平行性，能避免技術(shù)誤差，檢測的樣本可以多路復(fù)用，并可以創(chuàng)建具有高精度和最小缺失值的大規(guī)模數(shù)據(jù)集，提高差異蛋白檢測效率[12]。與凝膠方法相比，應(yīng)用TMT技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)膜蛋白、核蛋白及胞外蛋白，對低豐度蛋白質(zhì)亦有較好的檢出率[11]。TMT技術(shù)目前在國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于篩選腹主動脈瘤、胰腺癌、乳腺癌等疾病生物標(biāo)志物的研究中，篩選出了具有臨床應(yīng)用價值的生物標(biāo)志物，為疾病的研究提供了新的方法和思路[12-13]。

1.3非標(biāo)記定量(Label-free)技術(shù) Label-free定量蛋白組學(xué)是一種不依賴于同位素標(biāo)記的多功能新型定量蛋白組學(xué)技術(shù)，通過液質(zhì)聯(lián)用對蛋白質(zhì)酶解肽段進(jìn)行分析，與iTRAQ、TMT技術(shù)相比，Label-free技術(shù)不需要穩(wěn)定同位素標(biāo)簽作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，通過分析鑒定蛋白質(zhì)時所產(chǎn)生的質(zhì)譜分析次數(shù)或質(zhì)譜峰強度比較不同樣本中相應(yīng)肽段的信號強度，就能估計不同樣品之間蛋白質(zhì)豐度的變化，對相應(yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行相對定量分析；Label-free技術(shù)目前已成為臨床上用于篩選生物學(xué)標(biāo)志物研究的高通量定量蛋白組學(xué)方法之一[14]。在所有用于差異化肽段定量分析的技術(shù)中，Label-free技術(shù)提供了最高的靈活性，并且由于軟件和硬件設(shè)備的最新進(jìn)展、更新，其使用范圍越來越廣，準(zhǔn)確率也在不斷提高[15-16]。與傳統(tǒng)的3D-Label-free技術(shù)相比，新一代4D-Label-free蛋白組學(xué)技術(shù)在檢測通量、深度、準(zhǔn)確率方面同時獲得了巨大的提升，可提供更高速度、更高靈敏度、更強大的分析性能，為蛋白組學(xué)與修飾組學(xué)分析帶來了更高的靈敏度和速度[17]。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)中氨基酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記(stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)技術(shù) SILAC是通過細(xì)胞培養(yǎng)物中的氨基酸進(jìn)行穩(wěn)定同位素標(biāo)記的高通量蛋白測序的一種蛋白組學(xué)技術(shù)[18]。SILAC技術(shù)屬于體內(nèi)標(biāo)記，標(biāo)記效率高且穩(wěn)定，無細(xì)胞毒性，樣品無需預(yù)處理，不僅適用于進(jìn)行全細(xì)胞蛋白質(zhì)的分析，也適用于膜蛋白的鑒定和定量分析，其多功能性可以擴展到產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)來量化組織中低豐度的蛋白質(zhì)，稱為Super SILAC[19]。SILAC技術(shù)自2002年推出以來，就成為化學(xué)家和細(xì)胞生物學(xué)家進(jìn)行生物學(xué)研究的常規(guī)方法以及定量蛋白組學(xué)研究、系統(tǒng)生物學(xué)研究的重要工具，廣泛用于發(fā)現(xiàn)血漿生物標(biāo)志物的研究中[20]。SILAC技術(shù)能夠清楚地鑒定和量化在腫瘤發(fā)生中必不可少的蛋白質(zhì)動力學(xué)，因此已廣泛用于癌癥蛋白組學(xué)的研究。例如，基于SILAC的質(zhì)譜儀進(jìn)行的全球蛋白組學(xué)分析提供了與乳腺腫瘤進(jìn)展相關(guān)的蛋白質(zhì)變化以及新的預(yù)后標(biāo)志物信息；基于SILAC的定量蛋白組學(xué)的應(yīng)用可以對人癌細(xì)胞間期和有絲分裂之間的表面蛋白質(zhì)組進(jìn)行詳細(xì)評估，從而為抗有絲分裂的癌癥化療提供潛在的藥效生物標(biāo)記[21]。

1.5雙向差異凝膠電泳(two-dimensional difference gel electrophoresis，2D-DIGE)技術(shù) 2D-DIGE是基于二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，D-PAGE)技術(shù)的定量蛋白組學(xué)技術(shù)，其分辨率和靈敏度高，變異性低，可以對樣本間蛋白質(zhì)豐度差異進(jìn)行精確分析[22]。與傳統(tǒng)的2D-PAGE技術(shù)相比，2D-DIGE技術(shù)中不同的樣品分別用不同的熒光染料標(biāo)記、混合，然后通過2D-PAGE分離，最后使用激光掃描儀對凝膠成像，因此2D-DIGE技術(shù)克服了凝膠間差異；此外2D-DIGE通過取消耗時的凝膠染色步驟提高了通量效率[23]。2D-DIGE技術(shù)具有可重復(fù)性、全面性、高通量等優(yōu)點，提供了更快、更可靠的凝膠匹配，可精確地檢測1 ng范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)含量，是目前廣泛用于篩選肺癌、乳腺癌、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病早期診斷生物候選標(biāo)志物及預(yù)測患者預(yù)后的常用工具，有助于促進(jìn)精密醫(yī)學(xué)的發(fā)展[24-25]。

1.6數(shù)據(jù)非依賴采集(data independent acquisition，DIA)技術(shù) DIA技術(shù)是一種新穎、全息式定量蛋白組學(xué)技術(shù)，開啟了高通量、全面定量蛋白組學(xué)的新領(lǐng)域，有效解決了鳥槍法、數(shù)據(jù)依賴性采集以及選擇性反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)存在的低豐度肽段信息丟失、重現(xiàn)性不佳、定量分析準(zhǔn)確率不高等不足[26]。DIA技術(shù)操作流程簡單有效，具有使用范圍廣、蛋白定量能力強、鑒定出的肽段和蛋白質(zhì)的數(shù)量全面、無同位素標(biāo)記要求、監(jiān)測成本低等優(yōu)點，可以對數(shù)千種蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析，提高了差異蛋白檢測特異性，使檢測蛋白缺失值更少[27]。DIA技術(shù)在目標(biāo)蛋白組學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，目前在診斷試驗、疾病預(yù)后評估及候選生物標(biāo)志物篩選研究中常規(guī)使用[28]。

1.7平行反應(yīng)監(jiān)測(parallel reaction monitoring，PRM)技術(shù) PRM是一種以四極桿-高分辨質(zhì)譜平臺、基于高精度質(zhì)譜的靶向蛋白組學(xué)技術(shù)，能夠?qū)δ繕?biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行選擇性檢測，從而實現(xiàn)對目標(biāo)蛋白質(zhì)的絕對定量[29]。PRM技術(shù)是相對于傳統(tǒng)選擇性反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)建立起來的高分辨監(jiān)測技術(shù)，目前被認(rèn)為是質(zhì)譜定量的金標(biāo)準(zhǔn)，與蛋白免疫印跡法、酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫組織化學(xué)等傳統(tǒng)的檢測驗證方法相比，PRM驗證具有靈敏度和特異度高、高通量(一次可檢測數(shù)10種蛋白)、準(zhǔn)確率高、不依賴抗體、所需實驗周期短等優(yōu)點，在臨床生物標(biāo)志物的篩選研究中被廣泛應(yīng)用，是目前目標(biāo)蛋白驗證的主流方法[30]。隨著蛋白組學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步進(jìn)展，可以預(yù)見未來PRM技術(shù)的應(yīng)用范圍將進(jìn)一步拓展，進(jìn)而取代低分辨率的目標(biāo)蛋白檢測及驗證技術(shù)[31]。

2 定量蛋白組學(xué)技術(shù)在篩選AAD早期診斷標(biāo)志物中的應(yīng)用

2.1iTRAQ技術(shù)與AAD 既往有研究報道，用iTRAQ技術(shù)對主動脈瘤患者血漿標(biāo)本進(jìn)行高通量篩選以尋找主動脈瘤早期診斷生物標(biāo)志物[32]；Zhang等[33]使用iTRAQ技術(shù)對Stanford A型AAD患者和行冠狀動脈旁路移植術(shù)的冠心病患者的升主動脈組織標(biāo)本進(jìn)行差異蛋白篩查，以尋找AAD患者早期診斷生物標(biāo)志物，結(jié)果顯示，相對于冠心病對照組，Stanford A型AAD組中共篩選出36種顯著差異表達(dá)蛋白，其中19種蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，17種蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，差異表達(dá)率超過1.5倍(>1.5或<0.66)；他們用蛋白免疫印跡法進(jìn)一步驗證Fibrillin-1、Emilin-1、Decorin、DJ-1和Histone H4 5種差異蛋白在上述兩類升主動脈平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)水平，結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)化生長因子-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相互作用的Fibrillin-1、Emilin-1和Decorin三種重要蛋白通過轉(zhuǎn)化生長因子-β信號通路導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)重塑，可能參與AAD的形成。Xiao等[34]用iTRAQ技術(shù)分析AAD患者和健康對照組的血清樣品，結(jié)果顯示，164種蛋白達(dá)到定量標(biāo)準(zhǔn)，其中64種上調(diào)蛋白和61種下調(diào)蛋白差異表達(dá)率超過1.2倍；進(jìn)一步擴大樣本量，用AAD患者和表現(xiàn)為急性胸痛的非AAD患者血清標(biāo)本驗證上述差異蛋白，并選擇差異表達(dá)率高的Lumican蛋白、C反應(yīng)蛋白、血小板反應(yīng)蛋白-1及D-二聚體作為候選生物標(biāo)志物，探討這些候選生物標(biāo)志物對AAD的診斷價值，結(jié)果顯示，AAD組中D-二聚體、Lumican的表達(dá)水平顯著高于對照組；為了分析驗證診斷試驗的準(zhǔn)確性，繪制了受試者工作特性曲線，Lumican和D-二聚體曲線下面積分別為0.895和0.891；采用Lumican和D-二聚體對AAD聯(lián)合診斷，靈敏度為88.33%，特異度為95%；這些結(jié)果表明，Lumican和D-二聚體聯(lián)合檢測可以優(yōu)化AAD診斷的靈敏度和特異度，能有效提高AAD早期診斷的靈敏度和準(zhǔn)確率。另外，Gu等[5]用iTRAQ技術(shù)鑒定AAD的潛在血清生物標(biāo)志物，將研究對象分為AAD組、AMI組和健康志愿組，從三組中收集血清樣本用于iTRAQ分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對于AMI組和健康志愿組，AAD組共鑒定出174種顯著差異表達(dá)蛋白，其中46種蛋白差異表達(dá)率超過2倍；基于上述iTRAQ發(fā)現(xiàn)，他們選擇了可能與血管損傷相關(guān)的Fibronectin蛋白和Lumican蛋白，用AAD和正常對照組血清對上述兩種蛋白進(jìn)行ELISA驗證，ELISA初步分析發(fā)現(xiàn)，AAD組與對照組中Lumican蛋白表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.003)，而兩組間Fibronectin蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.685)；再進(jìn)一步擴大樣本量，用血清樣品對Lumican蛋白進(jìn)行ELISA驗證，結(jié)果顯示，相對于正常對照組和AMI組，AAD組Lumican蛋白水平顯著增加，表明基于iTRAQ技術(shù)發(fā)現(xiàn)的Lumican蛋白是一種潛在的診斷標(biāo)志物，可能有助于AAD的早期診斷。

2.2Label-free技術(shù)與AAD 近年來，Label-free技術(shù)廣泛用于蛋白組學(xué)研究，有效提高了結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌等疾病診斷的準(zhǔn)確率，極大地縮短了疾病診斷時間，為盡早精確診療提供了幫助[15]。王河清等[35]收集AAD患者和健康人血清各3份，進(jìn)行Label-free檢測，共鑒定出648種蛋白，通過t檢驗對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[認(rèn)定蛋白差異倍數(shù)>4.00或<0.25(P<0.05)為差異顯著的蛋白]，得到了12種顯著差異表達(dá)的蛋白，其中紐蛋白的差異表達(dá)率顯著高于其他蛋白，并將紐蛋白設(shè)為夾層撕裂時主動脈壁釋放出的特異性蛋白，因此紐蛋白被選為該研究的目標(biāo)蛋白；進(jìn)一步收集AAD患者、AMI患者和健康人血清各9份，對紐蛋白進(jìn)行ELISA驗證，同時收集AAD患者升主動脈組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測；ELISA驗證結(jié)果表明，AAD組與AMI組和健康對照組相比紐蛋白水平并沒有升高，而免疫組織化學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，主動脈發(fā)生撕裂位置的紐蛋白分布較未發(fā)生撕裂位置密集，表明紐蛋白可能參與AAD的發(fā)病過程，是一種具有研究價值的AAD潛在生物標(biāo)志物。

2.3PRM技術(shù)與AAD 馬方綜合征是由原纖蛋白-1基因突變引起的遺傳性結(jié)締組織疾病，有胸主動脈瘤和胸主動脈夾層發(fā)生的風(fēng)險，且胸主動脈瘤破裂或胸主動脈夾層是馬方綜合征的主要死亡原因。Yin等[36]用質(zhì)譜方法分析了胸主動脈瘤合并馬方綜合征組與胸主動脈瘤未合并馬方綜合征組患者的細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白水平，并通過PRM技術(shù)對糖蛋白進(jìn)行定量分析，首次證明了馬方綜合征患者中存在與原纖蛋白-1相互作用的微原纖維相關(guān)蛋白4(microfibril-associated glycoprotein 4，MFAP4)的異常糖基化，且合并馬方綜合征的主動脈瘤患者M(jìn)FAP4糖基化作用較未合并馬方綜合征的動脈瘤患者顯著增強；MFAP4在馬方綜合征患者的主動脈血管壁中表達(dá)豐富，其信使RNA水平在馬方綜合征患者升主動脈中顯著升高，且高M(jìn)FAP4血漿水平患者隨訪期間發(fā)生了Stanford B型主動脈夾層。證明MFAP4是一種有希望的候選血漿生物標(biāo)志物，可用于識別發(fā)生Stanford B型AAD風(fēng)險較高的馬方綜合征患者，對發(fā)生Stanford B型AAD風(fēng)險較高的馬方綜合征患者進(jìn)行更密切的監(jiān)測以避免AAD的發(fā)生。

3 小 結(jié)

AAD是一種非常兇險的心血管疾病，由于缺乏快速、準(zhǔn)確的檢測手段，經(jīng)常會貽誤病情，失去最佳治療時間窗，導(dǎo)致高病死率，對人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。理想的生物標(biāo)志物應(yīng)具備非常高的靈敏度和特異度，且使用方便、安全、經(jīng)濟。目前對于AAD的快速診斷尚無可用于臨床的理想生物標(biāo)志物。通過定量蛋白組學(xué)已經(jīng)篩選出許多AAD生物標(biāo)志物候選物，但還未應(yīng)用于臨床。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PRM、DIA、4D Label-free等新型定量蛋白組學(xué)技術(shù)將逐漸取代傳統(tǒng)質(zhì)譜技術(shù)，越來越多地應(yīng)用于臨床研究，使AAD生物標(biāo)志物開發(fā)的效率及實用性進(jìn)一步提高，篩選出具有高靈敏度、高特異度以及具有實際診斷應(yīng)用價值的標(biāo)志物，實現(xiàn)AAD的快速早期診斷，使AAD患者得到及時的治療，降低病死率。