微RNA在多囊卵巢綜合征發病機制中的研究進展

李憶昆，沈山梅

(東南大學醫學院南京鼓樓醫院內分泌科，南京 210008)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡期女性常見的生殖內分泌和代謝疾病，其發病率高達5%～10%[1]。PCOS主要以稀發排卵(無排卵)、卵巢多囊樣改變和雄激素過多為特征。許多患有PCOS的女性還患有胰島素抵抗，高胰島素血癥可促進卵巢(和腎上腺)雄激素的產生，并通過降低性激素結合球蛋白水平來增加雄激素的生物利用度。PCOS的發病機制尚不明確，近年研究表明，遺傳和環境因素與PCOS密切相關，PCOS是一種多基因病，目前的候選基因研究涉及胰島素作用相關基因、高雄激素相關基因等[2]。微RNA(microRNA，miRNA)是一類長約22個核苷酸的非編碼RNA，通過與靶基因的互補或非互補結合參與生物的合成、分化、增殖、凋亡及信號轉導。近年來研究發現，部分miRNA表達在多種疾病中發生了改變，并且通過上述各種途徑參與了疾病的病理生理過程，如癌癥、代謝疾病和生殖異常等[3-5]。迄今為止，許多學者已經探索了PCOS的miRNA表達差異譜，發現部分miRNA與卵泡發育、雄激素異常和胰島素敏感性直接或間接相關[6]，這使得miRNA有望作為PCOS新的診斷生物標志物及治療的靶點。現就miRNA在PCOS發病機制中的研究進展予以綜述。

1 miRNA概述

miRNA最早被發現于20世紀90年代初[7]，但直到21世紀初，科學家才開始意識到這些無處不在的小分子在真核基因表達調控中所起的廣泛作用[8]。基因組通過RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ，轉錄為包含成熟序列的發夾結構的初級miRNA，由重組人核糖核酸酶3及其輔因子負責切除發夾，產生前體miRNA，通過輸出蛋白5從細胞核轉運至細胞質；另一種含有Dicer酶的蛋白質復合物進一步加工前體miRNA，產生含有成熟miRNA的雙鏈復合物[9]。miRNA主要參與生物體內的轉錄后調控，它對靶基因mRNA的作用主要取決于與mRNA 3′非翻譯區的堿基序列互補的程度，與之完全互補結合的miRNA能夠切斷靶基因的mRNA，而與之不完全互補結合的miRNA能夠抑制靶基因的翻譯[10]。研究顯示，預計超過60%的人類基因是miRNA的靶標，并且許多miRNA能夠靶向多種mRNA[11]。miRNA水平的微小偏差可能擾亂許多靶基因的調節，因此，控制miRNA生物發生對于維持正常細胞生物學至關重要。對miRNA功能的干擾可導致許多人類疾病的發生。研究顯示，女性體內有多種miRNA參與卵巢激素代謝、顆粒細胞增殖和凋亡、卵泡發育與閉鎖調控等，卵巢miRNA的表達異常或功能障礙會影響卵泡發育與閉鎖以及激素的合成和代謝，導致PCOS等卵巢源性疾病的發生[12]。

2 miRNA參與PCOS的病理生理過程

2.1miRNA與卵巢激素 異常的卵巢類固醇激素合成與代謝參與PCOS的發生[13]。miRNA的表達可能對類固醇合成代謝涉及的特定基因的表達具有直接的調節作用[14-15]。因此，了解miRNA影響卵巢類固醇激素的機制對于類固醇相關疾病(如PCOS)具有重要意義。

雄激素對女性的生殖功能有重要意義，具有生物活性的睪酮為游離睪酮，其水平僅為總睪酮的1%～2%，血液循環中的睪酮主要與性激素結合球蛋白或白蛋白結合[16]。過量的雄激素是PCOS的病理生理學特征之一。Murri等[17]發現，部分miRNA的血清表達水平在PCOS患者中與男性對照組相似，而與正常女性對照組有差異；此外，這些miRNA(miR-193a-5p、miR-199a-3p和miR-597-5p)水平與血清睪酮和雌二醇水平具有相關性。Xue等[18]的鑒定結果顯示，PCOS卵泡液中7種miRNA(miR-200a-3p、miR-10b-3p、miR-200b-3p、miR-29c-3p、miR-99a-3p、miR-125a-5p和miR-105-3p)與PCOS中的高雄激素血癥相關。另有研究報道，miR-93和miR-21在PCOS卵巢顆粒細胞中表達增加，并且與游離睪酮和雄激素指數呈正相關；進一步分別用雙氫睪酮和比卡魯胺處理顆粒細胞后，雙氫睪酮誘導miR-93和miR-21上調，而用比卡魯胺預處理的顆粒細胞能阻斷雙氫睪酮對miR-93和miR-21表達的影響[19]。miR-93和miR-21可通過靶向受體基因Smad 7調節轉化生長因子-β信號通路，從而減少雄激素的生物合成，促進卵泡發育[20-21]。

PCOS還與持續快速的促性腺激素釋放激素脈沖、過量的促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)和不足的促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone，FSH)分泌有關，可導致過多的卵巢雄激素生成和排卵功能障礙[22]。卵泡膜細胞在LH刺激下將膽固醇合成為雄激素，卵巢顆粒細胞在FSH刺激下將睪酮和雄烯二酮轉化為雌激素[23]。在雙氫睪酮處理的PCOS大鼠中，miR-132的下調與LH水平相關[24]。此外，Sang等[25]發現，卵泡液中下調的miR-132和miR-320通過靶向高遷移率族蛋白A2和Ras相關蛋白5B基因，抑制雌二醇的合成，從而參與PCOS高雄激素血癥的發生。雌雄激素的生物轉化主要依賴于芳香化酶p450基因(cytochrome p450 genes，Cyp19a1)編碼的芳香酶[26]。在PCOS模型鼠中，miR-27a-3p表達增加，其通過靶向環磷腺苷效應元件結合蛋白1(cAMP-response element binding protein 1，Creb1)激活下游基因Cyp19a1，導致雌二醇和雄激素失衡，而高水平的雄激素還可反向激活miR-27a-3p，進一步促進PCOS的雄激素代謝紊亂[27]。在以劑量依賴性上調miR-383水平后，通過抑制轉錄因子RBMS1(RNA binding motif single stranded interacting protein 1)基因，小鼠顆粒細胞Cyp19a1基因表達增加，釋放更多的雌二醇[28]。另外，目前已在PCOS卵泡液中檢測到上調的miR-383水平，其可能通過Cyp19a1介導PCOS異常升高的雌激素[29]。上述miRNA的差異表達可能解釋異常的雄激素，并有助于鑒定以高雄激素為表型的PCOS。

2.2miRNA與胰島素抵抗 患有PCOS的女性會增加糖代謝紊亂風險，據報道PCOS患者的胰島素抵抗發生率超過70%[30]。葡萄糖主要通過胰島素反應性葡萄糖轉運體4(glucose transporter 4，GLUT4)穿過細胞膜進入細胞[31-32]。檢測GLUT4在4組女性(PCOS合并胰島素抵抗、單純PCOS、對照合并胰島素抵抗和單純對照)脂肪細胞中的表達發現，miR-93、miR-133和miR-223在PCOS女性中過表達，miR-93主要通過抑制GLUT4，損害葡萄糖跨膜轉運，從而參與PCOS胰島素抵抗的發生[33]。既往有研究提示，miR-133和miR-223靶向GLUT4表達并調節葡萄糖代謝[34-37]。此外，與正常胰島素敏感性的3T3-L1脂肪細胞相比，miR-320的表達水平在具有胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細胞中增加50倍，在加入抗miR-320寡核苷酸后，胰島素敏感性得到恢復，GLUT4表達上調，胰島素介導的葡萄糖攝取增加[38]。

多個信號通路相互作用共同調節細胞增殖及胰島素代謝，胰島素與磷酸化底物分子的受體結合后，底物磷酸化水平升高[39-40]。除了影響葡萄糖的轉運外，部分miRNA還參與胰島素信號通路中重要基因的表達。miR-9、miR-18b、miR-32、miR-34c和miR-135a在PCOS女性中過表達，且通過靶向胰島素受體底物2、突觸結合蛋白1和白細胞介素-8，影響碳水化合物代謝和胰島β細胞的功能、細胞間信號轉導及類固醇激素合成等[29]。而miR-145被發現能夠抑制顆粒細胞的增殖，并靶向胰島素受體底物1基因，調節磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路，改善PCOS的胰島素抵抗[41]。此外，在使用來曲唑建立的PCOS模型鼠中檢測到了miR-484、miR-375-3p、miR-324-5p、miR-223-3p、miR-201-5p、miR-34b-5p、miR-141-3p和miR-200a-3p的差異表達，這些miRNA參與胰島素分泌和信號轉導(如Wnt、腺苷酸活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B和Ras)[42-43]。miRNA通過參與葡萄糖轉運與胰島素信號通路影響PCOS女性胰島素抵抗的發生，為疾病提供了新的治療靶點。研究發現，合氣散作為一種中藥，可能通過介導miR-144-3p對胰島素抵抗的PCOS治療有益[44]。二甲雙胍是治療胰島素抵抗的PCOS患者使用最廣泛的藥物，二甲雙胍可降低肝葡萄糖產生，同時刺激胰島素敏感組織中的葡萄糖攝取并改善脂質代謝，給予二甲雙胍可能改變幾種miRNA的表達模式。例如，miR-221和miR-222的表達水平在糖尿病患者中升高，而在二甲雙胍治療患者中的表達水平與非糖尿病患者相似[45]。此外，還有部分二甲雙胍對各種癌癥miRNA表達改變的研究[46-47]，但尚未有關于二甲雙胍治療PCOS后miRNA表達變化的研究。

2.3miRNA與卵泡發育 卵泡的發育是涉及多個細胞、多個階段的復雜過程。卵丘細胞是圍繞在卵母細胞外周并與之進行代謝聯系的顆粒細胞群。卵丘細胞的主要功能是在排卵前將營養和新陳代謝轉移到卵母細胞。因此，卵丘細胞的生物學變化影響卵母細胞的發育。在PCOS卵丘細胞中，Liu等[48]發現，miR-hsa-miR-513-3p、miR-508-3p、miR-513b和miR-144顯著過表達，而miR-hsa-miR-455-3p和miR-615-3p低表達。Shi等[49]發現，miR-483-5p和miR-486-5p表達降低，且它們的靶基因與胰島素抵抗、糖耐量異常及2型糖尿病密切相關。胰島素樣生長因子2的高表達提示卵母細胞更好的成熟，作為miR-483-5p的共表達基因，胰島素樣生長因子2基因在PCOS組的卵丘細胞中也低表達[50]。另外，降低人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因的水平可能促進卵泡的發育，miR-486-5p下調可誘導卵丘細胞中人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因過表達，從而阻礙卵泡發育[51]。另外，PCOS女性卵丘細胞中miR-323-3p的水平顯著下調，miR-323-3p直接靶向胰島素樣生長因子1，調節類固醇生成和卵丘細胞活性，從而參與PCOS的發病[52]。

顆粒細胞凋亡增加、增殖率降低以及功能紊亂與PCOS的異常卵泡之間存在密切聯系[53-54]。目前已有部分研究探索了miRNA如何通過影響顆粒細胞參與PCOS的異常卵泡發育。Xu等[55]發現，miR-483-5p可能參與Notch信號轉導和胞外信號調節激酶通路誘導的顆粒細胞發育、分化和增殖的調節以及PCOS卵泡中異常激素微環境的負反饋環節。Fu等[56]發現，miR-16的表達在PCOS患者的卵巢皮質組織和血清中均下調，使得程序性細胞死亡蛋白4(programmed cell death protein 4，PDCD4)表達上調，顆粒細胞增殖率降低。此外，較高的PDCD4表達與PCOS中的肥胖、胰島素抵抗、脂質代謝紊亂及顆粒細胞凋亡有關[57]。表明，PCOS患者下調的miR-16直接靶向PDCD4，增強顆粒細胞凋亡并阻斷其增殖。其他研究發現，miR-145可靶向顆粒細胞中的胰島素樣生長因子1及激活素受體ⅠB，抑顆粒細胞增殖[41,58]。另外，還有幾項研究發現，上調的miR-27a-3p在卵巢顆粒細胞中通過靶向抑制Smad5和Creb1基因，抑制顆粒細胞增殖，并促進細胞凋亡及雌雄激素轉化，從而參與PCOS異常卵泡的發生[27,59]。Jiang等[60]發現，miR-324-3p轉染的PCOS大鼠顆粒細胞的增殖受到顯著抑制，細胞凋亡顯著增多，沉默其靶標基因 Wnt2B(wingless integrated 2B)表達，可以逆轉miR-324-3p對顆粒細胞增殖和凋亡的影響。

總之，卵巢miRNA的表達改變可能在卵丘細胞及顆粒細胞增殖和分化與凋亡的過程中起作用，從而參與PCOS異常卵泡發育的過程。

3 miRNA與不孕癥

Dicer1是一種RNaseⅢ酶，能將pre-miRNA加工成較短的miRNA雙鏈體，對于miRNA生物合成有重要作用[61]。Dicer的條件性卵巢組織特異性剔除的小鼠模型呈現不育、低卵巢重量、低排卵率、異常發情周期以及發育相關基因失調[62]，提示miRNA可能與女性不孕癥有關。不孕癥是多囊女性的臨床表現之一。研究發現，與可育供體胚泡相比，來自多囊卵巢或男性因子不育患者的形態相似的胚泡表現出特異性異常的miRNA譜，hsa-let-7a和hsa-miR-24在來自多囊卵巢與男性因子的胚泡組均顯著下降，hsa-miR-92、hsa-miR-93、hsa-miR-19a和hsa-miR-19b僅在來自多囊卵巢的胚泡組顯著下降；對6種miRNA表達的熱圖分析表明，與可育供體相比，多囊卵巢女性囊胚的熱圖譜與男性因素不育夫婦的熱圖譜明顯不同，而后兩者彼此相似；此外，對細胞分化有重要意義的miR-19a靶基因ARIH2(ariadne homolog 2)的表達僅在PCOS組中表現出上調，miR-24的兩個靶標[編碼信使RNA衰變促進因子KHSRP(K-homology splicing regulatory protein)和轉錄因子NFAT5(nuclear factor of activated T cells 5)基因]在PCOS組和男性因子組均下調[63]。

4 miRNA作為PCOS的生物標志物和治療靶點

在人血清中檢測到大量的miRNA，由于穩定性和可及性，miRNA可用作PCOS的非侵入性生物標志物[64]。研究發現，在PCOS患者中，miR-222、miR-146a和miR-30c的血清水平升高，而miR-320水平降低，并且3種上調的miRNA組合可以比單一的miRNA更有效地識別疾病，受試者工作特征曲線下面積達0.852[65]。miR-146a變異的女性發生PCOS的風險較高[66]，miR-146a的過表達增加了DNA損傷頻率并導致PCOS的發生[67]。另一項研究發現，PCOS患者的血清miR-122、miR-193b和miR-194與胰島素敏感性明確相關，聯合體質指數與miR-193b作為預測PCOS合并糖代謝受損概率的新指標，其受試者工作特征曲線下面積達0.752[68]。與健康受試者相比，PCOS女性血清中miR-23a和miR-23b水平降低[69]，其中miR-23a不受體質指數的影響，提示miR-23a比miR-23b更適合評估PCOS。Song等[70]發現，PCOS血清miR-6767-5p水平隨空腹血糖升高、月經頻率減少而下降，其靶向細胞周期和免疫系統，可能是診斷PCOS的生物標志物。在排卵治療期間，合并PCOS的女性患卵巢過度刺激綜合征的風險增加，血清miR-16可能比黃體生成素/卵泡刺激素對預測過度刺激綜合征更有效[71]，其產生差異性表達的機制可能是通過靶向血管內皮生長因子A介導炎癥反應。

5 小 結

近年來，關于PCOS女性miRNA表達的研究越來越多，但通過不同研究檢測到的miRNA的表達譜是不完整和重疊的，這可能與PCOS的復雜性和異質性以及大多數研究中樣本量的限制有關。此外，一個miRNA可能具有多個靶標，并且同一靶點的3′非翻譯區可能受多個miRNA的調控，這使得該網絡進一步復雜化。許多miRNA通過影響卵巢類固醇激素代謝紊亂、胰島素抵抗、卵泡異常發育參與PCOS的病理生理過程。鑒定女性體液或組織中的特定miRNA改變及相互作用有助于更好地闡明PCOS的發病機制。根據現有研究，miRNA還可以用作生物標志物以鑒定PCOS中的亞表型。許多miRNA模擬物、抗miRNA寡核苷酸和小干擾RNA治療劑正在開發中。但目前尚無治療方案直接靶向PCOS中的miRNA，研究相關miRNA制劑可能為將來PCOS治療提供新思路。