FTY-720通過TGF-β1/P38 MAPK/NF-κB信號通路對小鼠肺纖維化模型的影響

劉衛東，高 歌，劉函曄，延光海，李良昌，張婧瑤，崔 弘

(1. 延邊大學醫學院機能學實驗教學中心， 2. 吉林省過敏性疾病重點實驗室，3. 延邊大學醫學院解剖學教研室，延吉 133002)

肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是一種慢性、進行性和致死性的肺部疾病。它主要表現為過度分泌促纖維化介質，成纖維細胞的活化和增殖，凋亡抵抗性肌成纖維細胞的持續存在，病灶內炎癥細胞的募集等。其發病機制尚不明確[1]。特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種慢性間質性肺病，以普通型間質性肺炎的組織病理學模式為特征。在肺組織損傷早期，出現炎癥細胞募集，導致趨化因子和促炎細胞因子釋放，進而炎癥細胞大量募集、重塑和肺纖維化。IPF確診后，其平均生存期僅為2.8年，死亡率較大多數腫瘤略高，因此IPF被稱為一種“類腫瘤疾病”。而目前在臨床上用于抗纖維化藥物主要是吡非尼酮和尼達尼布[2]，其雖然有助于改善肺功能，緩解疾病癥狀，但不能顯著提高患者的生存率[3]。所以明確IPF發病機制，尋找靶向治療IPF的藥物成為了研究重點。

轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的活化是最直接的促進肺組織纖維化因素，其作用于成纖維細胞，分泌大量膠原蛋白質(collagenI A1，COL1A1)或者誘導其分化為肌成纖維細胞，表達α-平滑肌肌動蛋白；而絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)，例如P38 MAPK能被TGF-β1磷酸化；核轉錄因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)是p38 MAPK的下游信號通路，在炎癥和纖維化中發揮重要作用[4,5]。

FTY-720(Fingolimod)是近年來新開發的免疫抑制劑，它是來源于中藥冬蟲夏草提取物中具有免疫抑制作用的成分ISP-I改造而成，其對自身免疫性心肌炎、多發性硬化、葡萄膜視網膜炎和動脈粥樣硬化具有顯著的保護作用[6]。FTY720是1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)的結構類似物，在體內被鞘氨醇激酶-2磷酸化形成FTY720-磷酸鹽(FTY720-p)，FTY720-p是S1P1、S1P3受體的激動劑，同時也是S1P1受體的功能拮抗劑。FTY720-p以高親和力結合S1P1R，誘導受體內化并使免疫細胞對S1P變得不敏感。FTY-720通過靶向TGF-β1信號通路改善腎纖維化[7],而對肺纖維化的研究尚不清楚。

本研究擬探討FTY-720對博來霉素誘導的小鼠肺纖維化的影響及其作用機制，并探討了其機制與TGF-β1/P38 MAPK/NF-κB信號通路的相關性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑

1.1.1實驗動物 由延邊大學實驗動物中心提供40只清潔干凈雄性BALB/c小鼠，體質量(18±5) g，許可證號：SCXK(吉)2017-0003。經延邊大學醫學院倫理委員會批準，本實驗開始進行，并遵守《實驗動物管理條例》。

1.1.2材料與試劑 博來霉素(Sigma, 美國)(貨號：203401)；FTY-720(Sigma, 美國)(貨號：SML0700批號：0000026872)；IL-1β(貨號：KMC0011)、TNF-α(貨號：BMS607-3) ELISA試劑盒(Invitrogen, 美國)；Masson染色液(索來寶, 中國)(貨號：G1345批號：20180418)；anti-TGF-β1(貨號：3711批號：7), anti-P38 MAPK(貨號：9212), anti-p-P38 MAPK(貨號：9215批號：7), anti-NF-κBp65(貨號：6956), anti-β-actin(貨號：4970批號：17) (Cell Signaling, 美國); anti-COL1A1 (Abcam, 美國)(貨號ab34710批號：GR158873-9)。

1.1.3儀器 2135型旋轉切片機(德國徠卡公司)；分光光度計(Thermo公司)；酶聯免疫吸附測定儀RT-2100C(美國雷杜公司)；5415D低溫高速多功能離心機(Eppendorf公司)；Western blot轉膜儀(Bio-Rad公司)；Amersham Imager 600自動化學發光凝膠成像分析儀(General Electric公司)；TXD3細胞圖片離心機(湘儀集團)。

1.2 實驗方法

1.2.1動物分組及模型制備 將40只雄性BALB/c小鼠隨機分為8組：生理鹽水對照組(Control)、BLM 模型組(BLM)、生理鹽水+FTY-720對照組(NS+FTY-720)、博來霉素+FTY-720組(BLM+FTY-720)，7天、14天分批處死，每組5只。各組小鼠適應性飼養1周后，Control組和NS+F組小鼠于第0天氣管內給予生理鹽水(100 μL)，第1、3、5天分別腹腔注射生理鹽水(100 μL)和FTY-720(1 mg·kg-1，100 μL)；BLM組和BLM+FTY-720組于第0天氣管內給予博來霉素(10 mg·kg-1，100 μL)，1、3、5天分別腹腔注射生理鹽水(100 μL)和FTY-720(1 mg·kg-1，100 μL)；給藥第7天和第14天小鼠進行處死，提取肺組織等備用于實驗。

1.2.2標本收集 各組小鼠分別在給藥7天和14天處死。小鼠吸入乙醚麻醉，頸部皮膚進行消毒并切開，鈍性分離皮下組織，暴露氣管，行氣管切開術，輕輕插入肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)軟管，結扎固定軟管，緩慢向肺組織中注射4℃生理鹽水1 mL，并輕輕按摩小鼠胸腔，重復3次，使抽出的肺泡灌洗液不低于0.6 mL。收集的肺泡灌洗液用低溫高速多功能離心機，以3 000 r·min-1離心5 min，將上清液保存在-80 ℃，離心后的沉淀物用于制備細胞涂片。收集BALF溶液后，取出小鼠的左肺并置于甲醛中固定，取出右肺并儲存在-80 ℃的環境中。

1.2.3肺組織學檢查 固定小鼠左肺48 h后，流水沖洗24 h。經常規脫水、包埋等步驟后，切片、鋪片以備用于HE和Masson染色。從每只小鼠中隨機選擇3張切片，并在光學顯微鏡下觀察它們的組織學變化。

1.2.4BALF中蛋白質含量及總細胞數測定 將在-80 ℃冷凍的BALF上清液在室溫水浴中快速解凍，通過BCA法測定蛋白質含量。離心BALF后，將生理鹽水溶液加入沉淀中，稀釋至200 μL，混合并置于細胞涂片離心機中。1 000 r·min-1離心10 min，再1 500 r·min-1離心5 min。將涂好的細胞涂片進行瑞士-吉姆薩染色，并在光學顯微鏡下進行總細胞計數。

1.2.5BALF中IL-1β、TNF-α含量的測定 酶聯免疫吸附實驗(ELISA)測定小鼠肺組織BALF中的IL-1β和TNF-α水平。通過使用由標準蛋白質產生的標準曲線計算濃度。

1.2.6免疫組化檢測肺組織中COL1A1的表達 將肺組織切片放于60 ℃的干燥器中熔蠟。然后二甲苯脫蠟；梯度濃度酒精脫水至PBS緩沖液，抗原高火修復15分鐘(檸檬酸鹽緩沖液)，自然降溫。PBS緩沖液洗片，然后與用一抗標記的一抗孵育過夜。最后，將切片用DAB染色，用蘇木精復染，脫水，洗滌并用二甲苯固定。隨機選擇5個不同的視野觀察。

1.2.7Western blot檢測肺組織中TGF-β1、p-P38 MAPK和NF-κB表達 根據每個試劑盒的要求，裂解并提取小鼠肺組織蛋白質，將相同量的蛋白質(40 μg)在10%的SDS-PAGE中以70 V恒壓電泳，切取目的條帶。300 mA低溫條件下轉膜。在脫脂奶粉封閉液中常溫封閉1.5 h。分別用小鼠TGF-β1、β-actin、P38 MAPK、p-P38 MAPK、NF-κB p65抗體4 ℃孵育過夜，將膜取出，在TBST中充分洗滌。洗膜后，加入HRP標記的相應二抗并在室溫下溫1.5 h。將膜取出，在TBST中洗滌后，使用Amersham Imager 600 自動化學發光凝膠成像分析儀進行曝光。

2 結果

2.1 FTY-720對博萊霉素誘導肺纖維化的作用

2.1.1FTY-720對肺組織病理學改變的影響 Fig 1A小鼠肺組織切片HE染色顯示，與對照組比較，BLM 7d肺組織結構紊亂，肺泡壁增厚，可見大量炎性細胞滲出，成纖維細胞增多，至14 d，組織結構破壞明顯，肺間質膠原纖維大量沉積。給予FTY-720明顯改善肺組織結構紊亂，減少肺間質膠原沉積。如Fig 1B Masson染色可見，對照組肺組織結構正常，模型組藍色膠原纖維沉積不斷增多，至14 d膠原纖維沉積最多，呈彌漫性分布，同時肺泡結構破壞明顯。給予FTY720，能明顯緩解上述肺組織病理變化。

2.1.2FTY-720影響BALF中蛋白質和細胞數 Fig 2A和Fig 2B結果與對照組相比，BLM小鼠肺組織BALF中蛋白質含量和細胞數顯著增加；給予FTY-720后，能顯著降低博來霉素誘導小鼠BALF中蛋白質含量和總細胞數。

2.1.3BALF中IL-1β、TNF-α含量的測定 檢測了小鼠肺組織BALF中的細胞因子含量。如Fig 3A和Fig 3B結果所示，相比于對照組小鼠，模型組小鼠BALF中IL-1β、TNF-α含量明顯上調；而FTY-720能夠明顯降低博來霉素誘導小鼠BALF中IL-1β和TNF-α水平。

2.1.4FTY-720能夠減少COL1A1的表達 Fig 4免疫組織化學結果顯示，模型組7 d和14 d小鼠肺組織與對照組比較，COL1A1的陽性表達明顯增加，而FTY-720處理后顯著降低陽性表達。

2.2 FTY-720通過TGF-β1/P38 MAPK/NF-κB信號通路抑制肺纖維化

2.2.1FTY-720對TGF-β1的表達有抑制作用 Western blot實驗結果顯示，BLM誘導小鼠肺組織中TGF-β1蛋白的表達水平較對照組明顯上體，FTY-720抑制小鼠TGF-β1蛋白表達水平，如Fig 5所示。

2.2.2FTY-720對博來霉素誘導肺纖維化中P38 MAPK磷酸化的影響 Fig 6結果顯示，模型組中7 d小鼠肺組織中p-P38 MAPK表達水平明顯升高，到14 d略下降；而FTY-720能夠明顯降低肺纖維化小鼠肺組織p-P38 MAPK的表達。

2.2.3FTY-720抑制NF-κB的活化 Fig 7結果顯示，7 d模型組核內NF-κB p65的水平與生理鹽水對照組相比明顯增多，14 d模型組核內NF-κBp65的水平較7 d略有降低，但與對照組比較明顯上調；給與FTY-720后能明顯抑制NF-κB p65的表達。

Fig 1 HE staining and Masson staining of lung tissues in mice of control group,BLM group,NS+FTY-720 group and BLM+FTY-720 group

A. HE stainingof lung tissues in mice; B. Masson staining of lung tissues in mice. The scale bar=100 μm.

3 討論與結論

肺纖維化是一大類肺疾病的終末期改變，以成纖維細胞增殖、細胞外基質(ECM)大量聚集并伴炎癥損傷、組織結構破壞嚴重為特征，在全球范圍內患病人數不斷攀升[8]。在本實驗中，BLM誘導小鼠肺纖維化模型，所建立的實驗模型是早期肺纖維化范疇。本實驗HE和Masson染色結果7 d主要表現為炎性細胞浸潤，14 d膠原纖維沉積急劇增加。因此，早期肺纖維化是以炎性細胞滲出為起點，研究表明，肺纖維化發生過程的關鍵階段正是因為早期肺纖維化的形成[9]。所以本實驗主要研究早期肺纖維化發生機制。

有研究表明，博來霉素誘導的肺纖維化中IL-1β以及TNF-α水平明顯升高[10]。成纖維細胞表面受體結合IL-1β，參與結締組織再生成。肺纖維化發生過程中，IL-1β起到介導炎癥及損傷，促進修復的作用；而過度修復則引起間質纖維化。TNF-α可直接作用于肺成纖維細胞，促進其增殖；也可以通過偶聯表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR )發揮作用。因此本實驗測定了BALF中IL-1β、TNF-α水平，ELISA結果顯示BLM誘導小鼠肺組織BALF中IL-1β、TNF-α水平顯著升高；在BLM組中，給藥7 d比14 d小鼠BALF中IL-1β、TNF-α水平高，說明炎癥反應的高峰期在7 d；FTY-720下調上述因子水平。上述結果說明博來霉素誘導的小鼠肺纖維化，開始以肺部炎癥為主要病理表現，而到14天時肺組織炎癥逐漸演變為肺纖維化，呈現肺組織細胞外基質過度度沉積。廣泛纖維化的特征是以細胞外基質 (extracellular matrix，ECM) 過度沉積, 主要成分為CollagenI A1[11]。本實驗的模型組小鼠肺組織中CollagenI A1大量沉積，而給予FTY-720顯著降低了CollagenI A1的水平。同樣，博來霉素誘導BALF中的總蛋白濃度、總細胞數增加，FTY-720明顯降低上述水平。綜上所述，FTY-720抑制炎癥細胞的激活并參與肺纖維化的發展。

Fig 2 Determination of protein content and total cell number in

A. Determination of total protein content in BALF; B. Determination of total cell number in BALF.**P<0.01vscontrol groups.##P<0.01vsBLM groups.

Fig 3 Determination of IL-1β and TNF-α levels in BALF by

A. Determination of IL-1β levels in BALF; B. Determination of TNF-α levels in BALF.**P<0.01vscontrol groups.##P<0.01vsBLM groups.

Fig 4 COL1A1 positive expression

Immunohistochemical detection of COL1A1 expression in lung tissues. The scale bar=100μm.

Fig 5 Expression of TGF-β1 proteins detected by Western

A. Expression levels of TGF-β1 proteins in mouse lung tissues on day 7 and day 14; B. Quantitative analysis of A.**P<0.01vscontrol groups.##P<0.01vsBLM groups.

Fig 6 Expression of p-P38 MAPK proteins detected by Western

A. Expression levels of p-P38 MAPK proteins in mouse lung tissues on day 7 and day 14; B. Quantitative analysis of A.**P<0.01vscontrol groups.#P<0.05vsBLM groups.

Fig 7 Expression of NF-κBp65 proteins detected by Western

A. Expression levels of NF-κB p65 proteins in mouse lung tissues on day 7 and day 14; B. Quantitative analysis of A.**P<0.01vscontrol groups.##P<0.01vsBLM groups.

近年來，TGF-β1/ Smad2 / Smad3被認為是促進肺纖維化的經典信號傳導途徑。除Smad外，越來越多的證據表明，TGF-β1還能激活各種Smad非依賴性信號通路[12]。因此，本課題組詳細分析了非經典途徑TGF-β1/ P38 MAPK / NF-κB信號通路通過肺部炎癥反應或肺損傷促纖維化的潛在分子機制。研究表明，抑制P38 MAPK和NF-κB可以保護肝臟損傷和抗纖維化[13]。在本實驗中發現博來霉素激活TGF-β1/P38 MAPK/NF-κB信號通路，而FTY-720通過抑制上述信號轉導通路，抑制炎癥因子的產生，保護對博來霉素誘導的小鼠肺纖維化。

本研究證實了FTY-720對小鼠肺纖維化的保護作用，其機制與TGF-β1//P38 MAPK/NF-κB信號通路有關，表明FTY-720可能成為治療肺纖維化的新希望。