植物乳桿菌培養(yǎng)基的優(yōu)化

高玉榮，李大鵬，張鳳琴，方 舒，彭 貞，宋俊梅

（巢湖學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院，安徽合肥 238000）

0 引言

隨著人們生活水平的提高，開(kāi)發(fā)富含益生菌等具有改善人體健康功能的食品已經(jīng)成為食品行業(yè)的重要發(fā)展方向之一[1]。研究表明，植物乳桿菌是一種重要的益生菌，能分泌抗生物素類(lèi)物質(zhì)，對(duì)腸道致病菌產(chǎn)生的拮抗作用，從而對(duì)人體產(chǎn)生益生作用[2]。除此之外，某些益生菌還具有同化膽固醇、提高免疫力、抗氧化等特殊保健功能[3]。

為了更好地發(fā)揮益生菌的保健功能，必須獲得大量的益生菌活細(xì)胞。高密度培養(yǎng)技術(shù)是目前獲得高活菌數(shù)的有效方法。高密度培養(yǎng)技術(shù)是指微生物菌體在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后其細(xì)胞密度達(dá)到常規(guī)培養(yǎng)的10倍以上的生長(zhǎng)狀態(tài)[4]。一些學(xué)者對(duì)提高益生菌活細(xì)胞數(shù)的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究，取得了一定的研究進(jìn)展[5-6]。

前期試驗(yàn)從發(fā)酵食品中分離篩選到一株具有體外降膽固醇、降甘油三酯功能的益生菌植物乳桿菌G1-28。為了更好地發(fā)揮植物乳桿菌G1-28的益生作用、獲得大量的活細(xì)胞，試驗(yàn)以營(yíng)養(yǎng)肉湯為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對(duì)植物乳桿菌G1-28的培養(yǎng)基進(jìn)行了研究和優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

植物乳桿菌G1-28，從發(fā)酵食品中分離的具有體外降膽固醇和甘油三酯功能的益生菌，于巢湖學(xué)院食品工程實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 試劑

MRS培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；氫氧化鈉、葡萄糖、果糖、乳糖、淀粉、蛋白胨、酵母浸粉、硫酸銨、硝酸鈉、牛肉膏、硫酸鎂、氯化鈉、鹽酸，均為分析純。

1.1.3 儀器設(shè)備

TU-1810型紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司產(chǎn)品；LDZM-80KCs-III型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；PHB-401型PH計(jì)，上海天達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品；SHP-160型智能生化培養(yǎng)箱，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；TG16Ws型臺(tái)式高速離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品；SWCJ-2F型潔凈工作臺(tái)，蘇州市智拓凈化設(shè)備科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化及培養(yǎng)

將-20℃甘油管保藏的菌種，按照1%的接種量接入10 mL已滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃下靜置培養(yǎng)12～14 h進(jìn)行活化。然后，按照1%的接種量接入裝有50 mL已滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃下靜置培養(yǎng)12～14 h備用。

1.2.2 植物乳桿菌培養(yǎng)基的單因素試驗(yàn)

（1）碳源的選擇及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定。以營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以1%的葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、淀粉代替其中的碳源，培養(yǎng)后測(cè)定其對(duì)植物乳桿菌G1-28生長(zhǎng)的影響。培養(yǎng)條件為初始pH值6.0，接種量2%，于30℃下靜置培養(yǎng)16 h（下同）。以氮源1%，NaCl 0.5%為基礎(chǔ)，研究0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%碳源對(duì)植物乳桿菌G1-28生長(zhǎng)的影響。

（2）氮源的選擇及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定。以營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以1%的蛋白胨、酵母浸粉、硫酸銨、硝酸銨、牛肉膏替代其中的氮源，培養(yǎng)后測(cè)定其對(duì)植物乳桿菌G1-28生長(zhǎng)的影響。在確定的最佳氮源的基礎(chǔ)上，研究0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%的氮源對(duì)植物乳桿菌G1-28生長(zhǎng)的影響。

（3）硫酸鎂對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)的影響。在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中分別添加0，0.2‰，0.4‰，0.6‰，0.8‰，1.0‰硫酸鎂，培養(yǎng)后測(cè)定其對(duì)植物乳桿菌G1-28生長(zhǎng)的影響。

（4）番茄汁對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)的影響。將新鮮成熟番茄清洗干凈后去蒂去皮，切塊放入榨汁機(jī)中壓榨，得到新鮮的番茄汁。添加0，5%，10%，15%，20%新鮮番茄汁，培養(yǎng)后測(cè)定其對(duì)植物乳桿菌G1-28生長(zhǎng)的影響。

1.2.3 植物乳桿菌培養(yǎng)基研究的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)。

1.2.4 植物乳桿菌生長(zhǎng)量的測(cè)定

采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定植物乳桿菌活菌數(shù)[7]。將菌懸液進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)瑥闹羞x擇3個(gè)合適的菌懸液各0.1 mL，涂布在制備好的MRS固態(tài)培養(yǎng)基平板表面，于37℃下倒置培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)平板表面生長(zhǎng)的菌落數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)，即為植物乳桿菌G1-28活細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌培養(yǎng)基的單因素試驗(yàn)

2.1.1 碳源對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)的影響

（1）碳源種類(lèi)對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)的影響。

碳源種類(lèi)對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖1。

由圖1可知，植物乳桿菌G1-28在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中最高，乳糖和果糖相對(duì)較低，蔗糖和淀粉最低，表明葡萄糖作為植物乳桿菌G1-28的碳源，能更好地被利用并促進(jìn)其生長(zhǎng)繁殖。

（2）葡萄糖添加量對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)的影響。

葡萄糖添加量對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖2。

由圖2可知，植物乳桿菌G1-28在葡萄糖添加量為1.5%的培養(yǎng)基中活菌數(shù)最高，隨著葡萄糖添加量的增加，活菌數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能是由于葡萄糖添加量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致菌體呼吸加快，使一些代謝產(chǎn)物不能完全氧化而積累在培養(yǎng)基中，導(dǎo)致培養(yǎng)基中的pH值過(guò)低，影響某些酶的活性，不利于植物乳桿菌G1-28的生長(zhǎng)。因此，選擇1.5%的葡萄糖作為植物乳桿菌G1-28生長(zhǎng)的適宜添加量。

2.1.2 氮源對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)的影響

（1）氮源種類(lèi)對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)的影響。氮源種類(lèi)對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖3。

氮源是用于構(gòu)成菌體細(xì)胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的氮素來(lái)源，通?？梢苑譃橛袡C(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源。由圖3可知，植物乳桿菌在添加酵母浸粉、蛋白胨和牛肉膏等有機(jī)氮源的培養(yǎng)基中的活菌數(shù)顯著高于添加硫酸銨和硝酸銨等無(wú)機(jī)氮源的培養(yǎng)基。在有機(jī)氮源中酵母浸粉最利于植物乳桿菌G1-28的生長(zhǎng)。因此，確定酵母浸粉為植物乳桿菌G1-28生長(zhǎng)所需的最佳氮源。

（2）酵母浸粉添加量對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)的影響。

酵母浸粉添加量對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖4。

由圖4可知，酵母浸粉添加量在0.5%～2.0%時(shí)，植物乳桿菌活菌數(shù)呈上升趨勢(shì)，但當(dāng)酵母浸粉添加量大于2.0%時(shí)則呈下降的趨勢(shì)，因此選擇酵母浸粉添加量為2.0%。

2.1.3 硫酸鎂對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)的影響

硫酸鎂添加量對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖5。

由圖5可知，硫酸鎂對(duì)植物乳桿菌G1-28生長(zhǎng)的影響顯著，在硫酸鎂添加量為0.3‰的培養(yǎng)基中，活細(xì)胞數(shù)最大，但當(dāng)硫酸鎂添加量過(guò)大（大于0.3‰）時(shí)，不利于植物乳桿菌G1-28的生長(zhǎng)。因此選擇硫酸鎂添加量為0.3‰。

2.1.4 番茄汁添加量對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)的影響

番茄汁添加量對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖6。

番茄汁含有豐富的維生素、微量元素等營(yíng)養(yǎng)成分可以為乳酸菌提供糖類(lèi)、礦物質(zhì)和B族維生素等多種營(yíng)養(yǎng)成分。由圖6可知，番茄汁添加量對(duì)植物乳桿菌G1-28的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。在番茄汁添加量為0～10%的培養(yǎng)基中，植物乳桿菌G1-28活菌數(shù)呈增加的趨勢(shì)；當(dāng)番茄汁添加量大于10%時(shí)，呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，可能是由于番茄汁添加量過(guò)高，導(dǎo)致培養(yǎng)基的pH值過(guò)低，不利于植物乳桿菌G1-28的生長(zhǎng)，因此選擇番茄汁的適宜添加量為10%。

2.2 植物乳桿菌培養(yǎng)基的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，采用了L9（34）正交試驗(yàn)。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，正交驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表4可以看出，各因素對(duì)植物乳桿菌G1-28生長(zhǎng)的影響次序依次是酵母浸粉添加量＞葡萄糖添加量＞番茄汁添加量＞硫酸鎂添加量。最佳培養(yǎng)基配方為A2B3C2D1，此配方不在正交試驗(yàn)的9組配方中，因此需要進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

根據(jù)正交試驗(yàn)所獲得的最優(yōu)組合培養(yǎng)基成分，即葡萄糖添加量1.5%，酵母浸粉添加量2.5%，硫酸鎂添加量0.3‰，番茄汁添加量5%；在初始pH值6.0，接種量2%，于30℃下靜置培養(yǎng)16 h，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，測(cè)得植物乳桿菌G1-28活細(xì)胞數(shù)19.8×109CFU/mL，驗(yàn)證試驗(yàn)的活細(xì)胞數(shù)大于正交試驗(yàn)中的任一組合的結(jié)果，因此確定A2B3C2D1是最優(yōu)組合。

3 結(jié)論

以營(yíng)養(yǎng)肉湯為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過(guò)單因素試驗(yàn)研究表明，葡萄糖添加量、酵母浸粉添加量、硫酸鎂添加量、番茄汁添加量對(duì)植物乳桿菌G1-28生長(zhǎng)影響顯著。

通過(guò)正交試驗(yàn)確定植物乳桿菌G1-28最佳培養(yǎng)基配方為葡萄糖添加量1.5%，酵母浸粉添加量2.5%，硫酸鎂添加量0.3‰，番茄汁添加量5%，在此條件植物乳桿菌G1-28下活細(xì)胞數(shù)達(dá)19.8×109CFU/mL。