趨化因子fractalkine通過NF-κB信號通路調控足細胞損傷及凋亡的研究

馬敬雪　黃丹　鞏奇明　盧俊玲　尤燕舞

【摘要】 目的 探討趨化因子fractalkine（FKN）對小鼠足細胞炎癥因子分泌的影響及機制、對nephrin表達的影響及其在足細胞凋亡中的可能機制。

方法 培養小鼠足細胞，將細胞分為：①對照組;②rmFKN干預組;③rmFKN+SC514（抑制劑）組。采用流式細胞術檢測各組中足細胞的凋亡率。用蛋白質印跡法（Western blot）檢測足細胞nephrin、白介素6（IL6）、腫瘤壞死因子α（TNFα）、細胞核內核因子κB（NFκB）、Bax、Bcl2及細胞色素C（Cytochrome C，Cytc）蛋白表達水平。

結果 凋亡結果顯示，各組細胞培養48 h后，與對照組相比，rmFKN+SC514組凋亡率差異無統計學意義（P>0.05），rmFKN 組凋亡率升高，而rmFKN組與rmFKN+SC514組相比凋亡率升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。Western blot結果顯示，與對照組相比，rmFKN組nephrin的表達水平下調，rmFKN 組IL6、TNFα分泌增多，NFκB p65、Bax、Cytc表達水平上調，Bcl2表達水平下調，差異均有統計學意義（P<0.05）。與rmFKN組相比，rmFKN+SC514組IL6、TNFα蛋白分泌減少，NFκB p65表達水平下調，差異有統計學意義（P<0.05）。

結論 ①rmFKN可抑制足細胞nephrin的表達;②rmFKN可以促進足細胞IL6、TNFα的產生和分泌，NFκB的活化可能是其潛在機制;③rmFKN促進足細胞的凋亡，其作用可能通過NFκB信號通路調節Cytc的表達及Bax/Bcl2平衡有關。

【關鍵詞】 rmFKN;核因子κB;腫瘤壞死因子α;白介素6;nephrin;凋亡

中圖分類號：R692 文獻標志碼：A DOI：10.3969/j.issn.10031383.2020.01.004

【Abstract】 Objective To investigate the effect of fractalkine（FKN） on the secretion of inflammatory factors，the expression of nephrin and the possible mechanism of apoptosis in podocyte.

Methods Podocytes were cultured and randomly divided into three groups：control group，rmFKN group and rmFKN+SC514 （Inhibitor of NFκB p65） group.Podocyte apoptosis was detected by flow cytometry.The expression of nephrin，interleukin6（IL6），tumor necrosis factorα（TNFα），nuclear kernel factorκB（NFκB），Bax，Bcl2，and Cytc were detected by western blot.

Results The results of flow cytometry showed that there was no significant difference in the apoptosis rate of rmFKN+SC514 group compared with the control group （P>0.05），and the apoptosis rate of rmFKN group was higher than that of rmFKN + SC514 group （P<0.05）.Western blot showed that compared with the control group，the expression level of nephrin decreased，the secretion of IL6 and TNFα increased，the expression level of NFκB p65，Bax and Cytc increased，and the expression level of Bcl2 decreased in rmFKN group （P<0.05）.Compared with the rmFKN group，the secretion of IL6，TNFα and the expression level of NFκ B p65 were decreased in the rmFKN+SC514 group （P<0.05）.

Conclusion ①FKN can inhibit the expression of nephrin;②FKN can promote the production and secretion of IL6 and TNFα in potocyte，which may be associated with activation of the NFκB signaling pathway;③FKN can promote the apoptosis of podocytes，which may be related to the regulation of Cytc expression and the balance of Bax/Bcl2 by activating NFκB signaling pathway.

【Key words】 fractalkine;NFκB;TNFα;IL6;nephrin; apoptosis

足細胞是高度分化的腎小球臟層上皮細胞，包裹在腎小球毛細血管周圍，對維持腎小球的結構和功能起著重要作用。足細胞的破壞可能導致腎小球濾過功能受損[1]。研究表明足細胞的損傷或丟失是各種形式的腎小球疾病和慢性腎臟疾病最常見的早期臨床表現[2]，所以深入研究足細胞損傷及凋亡機制對腎小球疾病的預防、診斷與治療十分重要。趨化因子fractalkine（FKN），又被稱作CX3CL1，是CX3C類趨化因子超家族中唯一的成員[3]。FKN在動脈粥樣硬化[4]、腫瘤[5～6]、腎臟疾病包括狼瘡性腎炎[7～8]等多種疾病中發揮著重要作用，但是FKN在足細胞損傷及凋亡中的作用尚不清楚。該研究以小鼠足細胞為研究對象，探討FKN對足細胞核因子κB（NFκB）活化、其特異性蛋白nephrin表達及凋亡的影響，以初步證實FKN在足細胞損傷及凋亡中的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠足細胞株（MPC5）購于上海復旦大學細胞中心，凍存于右江民族醫學院科學實驗中心，RPMI1640細胞培養基、胎牛血清（Gibco生物公司），重組小鼠rmFKN（R&D，美國），SC514（Selleck，美國），凋亡檢測試劑盒購自于美國BD公司，兔抗IL6、TNFα一抗兔抗（Santa Cruz Biotechnology，美國），NFκB p65一抗（Cell Signaling Technology，美國），兔抗nephrin一抗（Abcam，美國），鼠抗GAPDH一抗（Proteintech，美國），兔抗Bax一抗、兔抗Bcl2一抗購自于Abcame公司;鼠抗Cytc一抗購于碧云天。羊抗鼠、羊抗兔IgG 抗體（二抗）（碧云天，中國）。蛋白酶抑制劑混合物（康為世紀，北京），BCA蛋白定量試劑盒（碧云天，中國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 足細胞培養

足細胞按照參考文獻培養及誘導分化[9]。細胞在10%胎牛血清的RPMI1640培養液，于37℃，5% CO2環境中傳代培養。2～3天換液1次。細胞融合至80%左右消化傳代，14天左右分化成熟后用于相關實驗。

1.2.2 rmFKN處理及分組

細胞傳代后，以1×105個細胞種于6孔板中，待各組細胞融合至60%～70%后用含1%胎牛血清的 RPMI1640 培養液同步化24 h將細胞分為3組，每組3個復孔。①對照組：足細胞置于37℃、5%CO2培養箱中培養。②rmFKN組：在足細胞培養液中加入rmFKN，終濃度為10 ng/mL[10]，37℃、5%CO2培養箱中培養。③rmFKN+SC514組：在足細胞培養液中加入SC514，終濃度為30 μM[11]，作用1 h后加入rmFKN，終濃度為10 ng/mL，37℃、5%CO2培養箱中培養。

1.2.3 Western blot法檢測蛋白表達

干預足細胞適當時間后收集各組足細胞，提取總蛋白。以二喹啉甲酸法測定蛋白濃度，取30～50 μg蛋白加入5×SDS上樣緩沖液煮沸變性后，于十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，300 mA恒流濕轉至PVDF膜，封閉液室溫封閉1 h，分別加入一抗稀釋液稀釋的nephrin（1∶500）、NFκB p65（1∶500）、IL6（1∶500）、TNFα（1∶500）、Bax（1∶500）、Bcl2（1∶500）、Cytc（1∶500）、GAPDH（1∶2000）抗體，4℃孵育過夜，洗滌3次，加入相應的抗兔或鼠IgGHRP二抗，室溫孵育1 h，洗滌3次，增強化學發光（ECL）顯影，利用Image J軟件進行半定量分析，以目的條帶與同個樣品GAPDH灰度值的比值表示相對光密度值。重復試驗3次。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡

足細胞按照前面分組培養48 h后收集各孔上清液于離心管中備用，然后再將各組細胞用4℃ PBS 清洗 2 次，胰酶消化后與前述上清液共同制成單細胞懸液，調整細胞密度為1×106個/mL，取 100 μL 細胞懸液加入 5 μL AnnexinVFITC 和 5 μL PI 溶液混勻，室溫避光孵育 15 min，加入 400 μL PBS，流式細胞儀進行檢測。重復試驗3次。

1.3 統計學方法

采用SPSS 23.0統計軟件進行數據分析，所有數據均進行正態分布和方差齊性檢驗。服從正態分布的數據以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間采用單因素方差分析。每個實驗組重復3次。檢驗水準：α=0.05，雙側檢驗。

2 結果

2.1 rmFKN對各組足細胞nephrin蛋白表達的影響

用rmFKN干預足細胞后，用Western blot檢測各組細胞nephrin表達水平。結果表明，rmFKN可誘導足細胞的nephrin表達下調，nephrin與內參GAPDH灰度值之比（0.89±0.04）與正常對照組的灰度值之比（1.44±0.02）差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 1。

2.2 Western blot檢測各組足細胞IL6、TNFα的表達

用rmFKN干預足細胞后，用Western blot檢測各組細胞IL6、TNFα蛋白的表達水平。結果表明，rmFKN可誘導足細胞中的IL6、TNFα表達上調，rmFKN 組、對照組IL6與內參GAPDH的灰度值之比分別為（0.85±0.04）、（0.42±0.05），差異有統計學意義（P<0.05）;rmFKN 組、對照組TNFα與內參GAPDH的灰度值之比分別為分別為（0.95±0.04）、（0.49±0.03），差異有統計學意義（P<0.05）。然而，rmFKN+SC514組IL6、TNFα表達下調，灰度值之比分別為（0.46±0.05）、（0.51±0.04），與rmFKN組相比，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖2。

2.3 Western blot檢測各組足細胞核內NFκB p65水平

Western blot檢測結果表明，rmFKN可誘導足細胞NFκB p65表達上調，NFκB p65與內參GAPDH的灰度值之比（0.90±0.03），與對照組（0.52±0.01）比較，差異有統計學意義（P<0.05）。然而， rmFKN+SC514 組NFκB p65（0.60±0.03）的表達下調，與rmFKN組灰度值之比差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。

2.4 FKN通過活化NFκB促進足細胞凋亡

凋亡結果顯示，各組細胞培養48 h后，rmFKN+SC514組的凋亡率（2.76±0.09）%與對照組（2.80±0.13）%比較，差異無統計學意義（P>0.05）。而rmFKN 組凋亡率為（6.75±0.28）%，與對照組及rmFKN +SC514組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。

2.5 rmFKN對足細胞Cytc、Bax及Bcl2表達的影響

Western blot檢測顯示，rmFKN干預足細胞后，rmFKN組Cytc及Bax表達上調，與內參GAPDH的灰度值之比分別為（0.71±0.05）及（0.99±0.01），與正常對照組（0.23±0.03）及（0.37±0.01）比較，差異有統計學意義（P<0.05）。然而rmFKN組的Bcl2表達下調，與內參GAPDH的灰度值之比為（0.24±0.00），與正常對照組（1.01±0.02）比較，差異有統計學意義（P<0.05）。對照組與rmFKN+SC514組相比，Cytc、Bax及Bcl2表達差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 5。

3 討論

足細胞是腎小球的特化上皮細胞，已知是腎小球疾病損傷的關鍵部位[12]。其數量減少或功能障礙將導致腎小球濾過功能損傷和相關腎臟疾病的發生。因此，足細胞凋亡被認為是腎小球疾病發展的一個十分重要的早期標志。炎癥是機體對于損傷因子的自我防御反應，其過程包括局部組織變質、血管內液體成分和細胞成分滲出以及組織細胞的增生。其中涉及多種細胞及因子參與。炎癥過程非常復雜，在大多數慢性疾病中起著重要作用，并且對人體、組織、細胞帶來巨大損害。研究發現，各種炎癥因子在足細胞的聚集是引起足細胞損傷的重要因素之一[12～15]。

Fractalkine（FKN）是CX3C類趨化因子超家族中唯一的成員，參與了趨化、細胞黏附、細胞生長的調節、炎癥免疫應答等[16]。近年研究發現FKN參與了包括腎缺血再灌注損傷、腎間質纖維化、新月體腎炎的發生與發展[17～18]。我們前期的研究發現FKN在狼瘡腎炎患者外周血及脂多糖誘導的腎小管上皮細胞損傷模型中的表達明顯增高[7，11]。但是其具體機制特別是在誘導足細胞損傷中的機制仍不明確。IL6及TNFα是兩種重要的炎癥介質。鄭柳穎等[19]研究發現FKN可以誘導外周血單核細胞分泌TNFα，從而誘導炎癥反應。本研究結果顯示，與對照組相比，rmFKN刺激足細胞后明顯上調IL6及TNFα蛋白的表達，提示刺激炎癥反應可能是FKN促進足細胞損傷的機制之一。我們課題組最新的研究發現，利用脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導小鼠足細胞損傷后FKN表達明顯升高，且與足細胞增殖、凋亡等密切相關[20]。但是FKN參與足細胞凋亡的具體機制有待進一步探究。在本實驗中我們通過使用rmFKN干預足細胞后，通過流式細胞術檢測發現足細胞的凋亡率明顯升高。這說明FKN可能在足細胞中發揮著促進凋亡并導致腎小球疾病發生的生物學活性。

為了進一步揭示rmFKN誘導IL6及TNFα分泌的機制，我們把目標聚焦到NFκB。NFκB在靜息狀態下以無活性的形式存在于胞漿中，當受到外界刺激時磷酸化的NFκB轉移至細胞核并誘發多種生物學反應[21]。本研究發現，rmFKN可以激活NFκB并促進NFκB p65的核轉移。NFκB與IL6及TNFα等炎癥因子的產生與分泌關系密切。既往研究發現高糖、脂多糖等可以激活NFκB后上調IL6及TNFα的表達[22～23]。我們使用NFκB的抑制劑SC514預處理足細胞，結果發現SC514預處理明顯抑制rmFKN誘導的IL6及TNFα產生。此外，SC514與rmFKN共同孵育足細胞后，其凋亡率明顯下降，表明rmFKN可能通過活化NFκB通路促進足細胞炎癥反應及凋亡。

Nephrin是定位于裂孔膜的足細胞特異性分子。多項研究表明nephrin在多種原發性和繼發性腎小球疾病中表達降低或分布異常，進而導致腎小球濾過功能改變而出現蛋白尿[24～25]。FKN是否會影響nephrin的表達，至今未見報道。在本研究中，我們用rmFKN刺激足細胞后進一步觀察nephrin表達的變化。結果顯示，rmFKN能抑制nephrin的表達。這可能是FKN參與足細胞損傷的機制之一。

細胞凋亡受多種途徑調控，其中線粒體途徑是調控凋亡的重要途徑之一。 Cytc是氧化呼吸鏈中基本成分之一，在線粒體凋亡途徑中起著至關重要的作用[26]。當細胞受到外界刺激后，由線粒體釋放到胞質中的Cytc可以介導Caspase的激活，進而發生級聯反應參與凋亡的發生[27]。有研究表明，Bax/Bcl2比例增加可以導致Cytc從線粒體釋放到細胞基質中[28]，Bcl2家族蛋白包括促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl2位于線粒體外膜[29]，這些蛋白的動態平衡決定著細胞生存[30]。為了探究Cytc及Bax/Bcl2平衡的變化是否參與了FKN介導的足細胞凋亡，在我們的研究中，用rmFKN干預足細胞后，用Western blot檢測了Cytc的表達量，結果發現，rmFKN組中Cytc及Bax的表達量明顯上調，Bcl2的表達量明顯下調，Bax/Bcl2的比例升高，說明FKN介導足細胞凋亡可能與Cytc及Bax/Bcl2平衡變化相關。鑒于前面FKN與NFκB之間的相互關系在足細胞凋亡中的作用，我們進一步驗證了NFκB與Cytc、Bax及Bcl2之間的關系，結果顯示，用rmFKN與SC415共同孵育足細胞后Cytc及Bax表達水平明顯下調，Bcl2的表達水平明顯上調，Bax/Bcl2的比例降低。綜上所述，FKN可能是通過NFκB信號通路調節Cytc的表達及Bax/Bcl2平衡進而參與足細胞凋亡的調控。

總之，本研究證實FKN可以抑制足細胞nephrin蛋白的表達，可能通過激活NFκB信號通路參與足細胞凋亡的過程，并初步揭示了FKN在調控足細胞炎癥反應及凋亡中的作用，對于更深入地了解FKN在足細胞損傷及凋亡中的機制有著重要意義。通過抑制FKN/NFκB信號通路的激活，可以減輕炎癥反應，抑制足細胞的凋亡，為由足細胞功能障礙導致的疾病的防治提供新的干預靶點。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2019-11-16 修回日期：2019-12-31）

（編輯：王琳葵 梁明佩）