補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)AD模型小鼠血腦屏障及MMP-2、MMP-9的影響

董曉紅，賈佩華，張正一，王悅陽(yáng)，劉斌*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

1 材料和儀器

1.1 藥物

于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院處購(gòu)買(mǎi)了藥物補(bǔ)陽(yáng)還五湯，同時(shí)在中醫(yī)藥研究院對(duì)其進(jìn)行煎制，于沈陽(yáng)第一制藥公司購(gòu)買(mǎi)吡拉西坦片(規(guī)格:0.4 g/片)。

1.2 動(dòng)物

于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司購(gòu)買(mǎi)3月齡的APP/PS1小鼠以及C57雄性小鼠，體質(zhì)量為(23±2)g，證書(shū)編號(hào):SCXK(Jing)2019-0001。在開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，先將小鼠進(jìn)行自適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，整個(gè)期間允許小鼠自由飲食。飼養(yǎng)環(huán)境濕度維持在50%，溫度25 ℃。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理相關(guān)規(guī)定。

1.3 試劑

甲酰胺溶液(天津天士力化學(xué)試劑)；2.5%的戊二醛及鋨酸(北京雷根生物技術(shù))；環(huán)氧樹(shù)脂(北京海德創(chuàng)業(yè)生物技術(shù))；EB(博奧拓達(dá)科技)；醋酸雙氧鈾(青島捷康生特科技)；檸檬酸鉛(湖北鑫鳴泰化學(xué))；二甲苯(哈爾濱三聯(lián)藥業(yè))；檸檬酸和過(guò)氧化氫(蘇州歐特化工)；免抗鼠MMP-2、MMP-9、COX-2(奧博森生物技術(shù)公司)。

1.4 儀器設(shè)備

酶標(biāo)光譜分析儀HBS-1096B、電熱節(jié)能恒溫水浴鍋HHS、透射電子顯微鏡HT7700、電熱節(jié)能恒溫高壓鼓風(fēng)干燥箱DGG9240B。

2 方法

2.1 建立AD小鼠動(dòng)物模型

隨機(jī)選取經(jīng)過(guò)了基因鑒定之后的雙轉(zhuǎn)基因小鼠(APP/PS1)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 分組及給藥

將雙轉(zhuǎn)基因小鼠(APP/PS1)小鼠隨機(jī)的分成補(bǔ)陽(yáng)還五湯高、中、低劑量組、腦康復(fù)組和模型組，以上各組小鼠均為12只，為假手術(shù)組另外選取和以上各組遺傳背景相同的SPF級(jí)C57小鼠12只，且都為3月齡。為假手術(shù)組和模型組小鼠分別灌入同體積蒸餾水；給予對(duì)照組小鼠0.63 g/kg的吡拉西坦；給予BYHWT各組的藥物劑量分別為37.59 g/kg、18.80 g/kg和9.40 g/kg。對(duì)于以上各組，每日進(jìn)行1次灌胃，持續(xù)20 d，最后1次給藥后進(jìn)行取材，其中6只鼠腦用于檢測(cè)EB含量，另外6只鼠腦切取部分用于TEM、IHC實(shí)驗(yàn)，剩余部分用于腦組織含水量的檢測(cè)。

2.3 腦組織水分含量的測(cè)定

各實(shí)驗(yàn)組末次給藥后斷頭取腦，對(duì)腦組織中的含水量進(jìn)行測(cè)量。在對(duì)腦組織濕重測(cè)量之后，將其轉(zhuǎn)移至干燥箱中(100 ℃)進(jìn)行烘烤，持續(xù)24 h后取出腦組織，測(cè)量烘干后腦重量，并進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄，再將數(shù)據(jù)代入到下列公式進(jìn)行腦組織含水量的計(jì)算:

蔣介石早年的教育偏重傳統(tǒng)，所受新式教育非常有限。蔣介石讀書(shū)注重修身與事功兩個(gè)層面，基本不脫傳統(tǒng)修齊治平的路徑。據(jù)蔣介石年譜記載:“1915年，公比年遁跡東京，銳志于學(xué)，每日看書(shū)習(xí)字，皆有常課，尤喜讀王陽(yáng)明、曾文正、胡文忠三集，朝夕不釋手。前在士官學(xué)校及陸軍大學(xué)所受課程秘本，與巴爾克戰(zhàn)術(shù)書(shū)，靡不逐一精研。軍事學(xué)即以巴爾克戰(zhàn)術(shù)書(shū)為基礎(chǔ)，而政治學(xué)則以王陽(yáng)明與曾文正二集為根柢也。”?

通過(guò)對(duì)腦組織的含水量進(jìn)行計(jì)算，就可以清楚的了解血腦屏障通透性的變化，檢測(cè)腦組織損傷的情況。

2.4 EB含量的測(cè)定

在末次給藥后，于大鼠的股靜脈處注射EB染色溶液，3 h后斷頭取腦。取小鼠左側(cè)大腦半球進(jìn)行稱(chēng)重處理，按1 mL/100 mg的比例將左側(cè)半球腦組織全部浸入甲酰胺溶液中，然后在60 ℃水浴鍋中孵育2 d。控制離心機(jī)參數(shù)r=1 000 r/min和T=5 min，進(jìn)行離心，完成后取上清液，測(cè)量其吸光度值。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并計(jì)算EB含量：稱(chēng)取4 mgEB并將其加入25 mL的生理鹽水中，此時(shí)可獲得160 μg/mL的EB溶液，再將其分別稀釋為0.125、0.25、0.5、1、2、4和8 μg/mL的溶液，統(tǒng)一置于60 ℃水浴鍋中避光孵育2 d，采用酶標(biāo)儀來(lái)對(duì)吸光值(λ=632 nm)進(jìn)行測(cè)定，再依據(jù)數(shù)據(jù)，獲得EB曲線(xiàn)。根據(jù)樣品OD值及EB曲線(xiàn)，便可得EB的濃度值，再根據(jù)下列公式換算出樣品EB含量。

EB含量(μg/g)=

2.5 TEM法觀察BBB的超微結(jié)構(gòu)

末次給藥后斷頭取腦，將腦組織移于冰上，切取大腦皮層并制成1 mm3的小塊。按照TEM實(shí)驗(yàn)操作步驟，對(duì)腦組織進(jìn)行浸泡、脫水、置換、包埋、聚合、切片、雙重染色、封片等操作，最后于TEM鏡下進(jìn)行拍照。

2.6 IHC法檢測(cè)MMP-2和MMP-9

將大腦皮層腦組織按照IHC實(shí)驗(yàn)操作要求，完成浸泡、脫水、包埋、切片、脫蠟等處理后，向樣品內(nèi)滴加一抗，將切片轉(zhuǎn)移到濕盒中，靜置在溫度為4 ℃的環(huán)境下過(guò)夜，再加入二抗。再經(jīng)顯色、復(fù)染、脫水等操作步驟之后，進(jìn)行封片。最后在顯微鏡下拍照并統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 BYHWD對(duì)AD腦組織水含量的影響

假手術(shù)組腦組織含水量低于模型組(P<0.01)。腦康復(fù)組、BYHWT中、高劑量組的腦組織含水量與模型組相比較均有所降低 (P<0.05、P<0.01)。由此可知，BYHWT中、高劑量組和腦康復(fù)組可以減少小鼠腦組織含水量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠腦組織含水量的比較

3.2 EB染色檢測(cè) BBB完整性結(jié)果

根據(jù)數(shù)據(jù)求得EB標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為：y=0.107 2X+0.061。將測(cè)得的樣品OD值代入該曲線(xiàn)中可知EB濃度，再經(jīng)上述公式換算為EB含量。由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可得，模型組小鼠EB滲入量比假手術(shù)組明顯增多(P<0.01)； BYHWT中、高劑量組和腦復(fù)康組大鼠EB滲入量比模型組則明顯減少(P<0.01)；其中以BYHWT高劑量組和腦復(fù)康組EB滲入量減少最為明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，BYHWT中、高劑量組對(duì)于改善BBB完整性方面具有一定作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠腦組織EB含量的比較

3.3 TEM對(duì)BBB的超微結(jié)構(gòu)觀察

通過(guò)研究分析發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組毛細(xì)血管基底膜和細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)正常，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和水腫情況。然而反觀模型組，細(xì)胞腫脹嚴(yán)重，緊密連接結(jié)構(gòu)受到損傷，毛細(xì)血管雙層結(jié)構(gòu)相對(duì)模糊。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，中、高劑量BYHWT組和腦復(fù)康組較之模型組毛細(xì)血管周?chē)仔阅[脹及緊密連接結(jié)構(gòu)的破壞情況均有所改善。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)附圖1。

注：A.假手術(shù)組;B.模型組;C.腦復(fù)康組;D.BYHWT高劑量組;E.DBYHWT中劑量組;F.DBYHWT低劑量組。圖1 BYHWD對(duì)AD小鼠BBB的影響(10 000×)

3.4 BBB損傷相關(guān)蛋白檢測(cè)結(jié)果

模型組MMP-2、MMP-9表達(dá)比假手術(shù)組明顯上調(diào)(P<0.01)，而B(niǎo)YHWT高、中劑量組、腦康復(fù)組中的MMP-9和MMP-2表達(dá)明顯下降(對(duì)照模型組)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示，BYHWT高、中劑量組可能通過(guò)下調(diào)MMP-2、MMP-9的表達(dá),減輕BBB破壞情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 BYHWT對(duì)大腦皮層MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響

4 討論

目前，西醫(yī)治療AD的主要藥物有膽堿酯酶抑制劑和NMDA受體拮抗劑，雖然在治療方面起到了延緩病情進(jìn)展的作用，但其長(zhǎng)期應(yīng)用也給患者帶來(lái)了大量的藥物不良反應(yīng)。BYHWT是臨床治療慢性腦血管疾病的常用藥物，本課題組前期研究也證明了BYHWT可以有效的改善AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。BBB是防止有害物質(zhì)進(jìn)入腦內(nèi)的重要組織結(jié)構(gòu)。一旦血腦屏障受到損害，屏障功能降低，導(dǎo)致不應(yīng)該透過(guò)血腦屏障的物質(zhì)進(jìn)入腦組織，并最終導(dǎo)致腦組織損傷[5]。本次研究以血腦屏障為切入點(diǎn)，探討了BYHWT對(duì)AD模型小鼠血腦屏障損傷的影響及其作用機(jī)制。

在該實(shí)驗(yàn)中，使用電子顯微鏡觀察了AD小鼠BBB的結(jié)構(gòu)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)BYHWT可以改善血腦屏障的病理變化。BYHWT高、中劑量組毛細(xì)血管雙層結(jié)構(gòu)和細(xì)胞間的緊密連接比較正常，細(xì)胞炎性浸潤(rùn)和水腫情況明顯比模型組有所減輕，從形態(tài)學(xué)水平證實(shí)了BYHWT治療AD是有效果的。

大腦的含水量增多從而導(dǎo)致腦容積增大，便會(huì)產(chǎn)生腦水腫。腦水腫的發(fā)病機(jī)制相對(duì)比較復(fù)雜。然而，相關(guān)研究結(jié)果表明，它與血腦屏障通透性的增加密切相關(guān)[6]。當(dāng)血腦屏障受損時(shí)，血管中的液體會(huì)迅速滲入到腦組織間隙中，從而導(dǎo)致腦水腫的發(fā)生[7]。反而言之，我們通過(guò)檢測(cè)腦組織中的含水量，就可以了解腦組織和BBB的損傷情況。結(jié)果提示，BYHWD中、高劑量組可以減少腦組織含水量，推測(cè)其可能通過(guò)改善腦組織BBB的通透性，從而減輕腦組織損傷的程度。

EB是一種染料生物制劑，其化學(xué)分子量和血漿蛋白類(lèi)似，與血漿蛋白具有較強(qiáng)的親和力。在正常情況下，兩者結(jié)合后不易通過(guò)血腦屏障，但當(dāng)BBB受損時(shí)，通過(guò)血腦屏障的EB就可以對(duì)腦組織進(jìn)行染色，因此，針對(duì)血腦屏障的通透性，可直接對(duì)進(jìn)入腦組織中的EB含量進(jìn)行監(jiān)測(cè)而得出[8]。由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可得，高、中劑量BYHWD組腦組織的EB含量比模型組有明顯降低，表明其對(duì)改善血腦屏障的完整性有一定的作用。

MMPs是一種明膠蛋白水解酶，含有Zn2+，細(xì)胞外基質(zhì)能夠被MMPs有效的降解，MMP-9和MMP-2是MMPs的主要成員。MMPs參與腦炎癥性反應(yīng)、神經(jīng)細(xì)胞凋亡以及新血管生成等諸多生理過(guò)程[9]。有研究表明AD模型小鼠海馬內(nèi)MMPs表達(dá)明顯增多，MMPs可以降解毛細(xì)血管基底膜蛋白從而導(dǎo)致血腦屏障被破壞，增加其通透性，最終導(dǎo)致白細(xì)胞浸潤(rùn)，產(chǎn)生腦水腫[10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BYHWT中、高劑量組可以降低腦組織中MMP-9和MMP-2的表達(dá)，提示BYHWT對(duì)血腦屏障的保護(hù)作用與有效的減低AD模型小鼠腦組織MMP-2和MMP-9的表達(dá)有關(guān)。

本研究中，對(duì)模型組小鼠腦組織含水量、EB含量和透射電鏡的直接觀察均說(shuō)明了AD模型小鼠出現(xiàn)了BBB損害的情況。補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療后降低了腦組織含水量、EB含量，有效改善了血腦屏障的形態(tài)完整性，并推測(cè)這種保護(hù)機(jī)制可能與其下調(diào)了用于評(píng)價(jià)BBB完整性的關(guān)鍵指標(biāo)MMP-2、MMP-9的表達(dá)，減輕了因基膜降解而導(dǎo)致的血腦屏障損害有關(guān)。本次實(shí)驗(yàn)為臨床使用補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療AD提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。在未來(lái)的研究中，還會(huì)進(jìn)一步探討補(bǔ)陽(yáng)還伍湯對(duì)BBB損傷的其他相關(guān)因子的影響及其作用機(jī)制，為中醫(yī)藥治療AD奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。