芪蛭膠囊對腦缺血再灌注損傷大鼠自噬相關因子PI3K、Beclin-1表達水平的影響

蔣希成，段芳芳，張婷婷，孫曉偉，姜國華，王兵，張浩，孫遠征，姜德友*

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150001)

腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)是指腦組織缺血又重新獲得血流灌注后，對腦組織產生的進一步損傷作用，是腦梗死常見的病理生理過程。自噬是一種細胞的自我修復整合機制，通過“自食”，清除受損細胞器，為細胞的修復提供物質基礎和能量基礎，在缺血缺氧誘導時，作為細胞應答而被激活，為機體提供氨基酸和脂肪酸來維持細胞代謝及ATP水平，維持機體運行[1]。多條信號通路參與自噬的調控，其中PI3K-Akt-mTOR信號通路研究最為深入，在自噬調控中扮演核心角色，具有抗炎、抗氧化應激、神經保護等多種積極作用[2]，抑制該通路中關鍵蛋白將阻斷該通路，從而激活自噬。當今人們大多處于久坐、缺乏運動、熬夜、飲食以肥甘較多、工作壓力大的背景條件下，氣虛血瘀又痰濕偏勝的體質不斷增加，課題組以益氣活血通絡為法創立的芪蛭膠囊，在治療缺血性腦中風病的臨床應用中獲得佳效[3]。在前期基礎上，本研究選擇MCAO/R模型，觀測PI3K-Akt-mTOR信號通路中關鍵蛋白PI3K，Beclin-1，探討芪蛭膠囊對CIRI的拮抗作用及分子機制。

1 材料

1.1 動物

健康SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠60只，6～8周齡，體質量(200±20)g，購置于遼寧長生生物技術有限公司(許可證編號：SCXK(遼)2015-0001)，保持實驗室內濕度維持45%～55%，溫度維持(22±1)℃，室內光線明暗循環為12 h/12 h，自由進食及飲水，實驗前適應性飼養1周。

1.2 藥物

芪蛭膠囊由黃芪、燙水蛭、丹參、地龍、石菖蒲、郁金、當歸、川芎等組成，藥材均購自黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，生產于黑龍江德順長中藥飲片有限公司。依據臨床等效劑量，根據人和大鼠體表面積折算用藥量，文火煎煮，旋轉蒸發濃縮至生藥含量為1.27 g/mL的藥液，密封，4 ℃冰箱保存備用。

1.3 主要試劑與儀器

主要試劑包括：3-MA(批號：M129496，阿拉丁)；rapamycin(批號S115842，阿拉丁)；LY294002(批號HY-10108，MCE)；PBS(批號：P10033，雙螺旋)；TTC(批號：A610558-0005，生工)；Western及IP細胞裂解液(批號：P0013，beyotime)；PMSF(批號：ST506，beyotime)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號：P0011，beyotime)；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(批號：P0015，beyotime)；BSA(批號：BS043，Biosharp)；山羊抗兔IgG(批號：A0208，beyotime)；ECL發光液(批號：P0018，beyotime)；內參抗體β-actin(批號：sc-47778，santa cruz)；Beclin-1(批號：11306-1-AP，Proteintech)；PI3K p85(批號：A11177，ABclona)；p-PI3K p85(批號：AF3241，Affinty)等。主要儀器設備包括：ALC-H型腦立體定位儀(上海奧爾科特生物科技)；臺式牙鉆機(中國上海齒科醫械廠)；微量注射器(鎮江康利醫療器械有限公司)；DW HL-668型超低溫冰箱(中科美菱)；水浴鍋(余姚市東方電工儀器廠)；電泳儀(型號：DYY-7C，北京六一)；雙垂直蛋白電泳儀(型號：DYCZ-24DN，北京六一)；凝膠成像系統(型號：WD-9413B型，北京六一)；超速冷凍離心機(型號：H-2050R，湖南湘儀)；水平搖床(型號：WD-9405B，北京六一)；酶標儀(型號：ELX-800，BIOTEK)等。

2 方法

2.1 分組及給藥

健康雄性SD大鼠60只，隨機分為6組，每組10只。A組：sham組；B組：模型組；C組：3-MA組(于造模前24 h在缺血側前囟點右側旁開1.4 mm，向后0.8 mm處，用牙科鉆打孔，用微量注射器抽取3-MA溶液10 μL(3 μg/μL)注入側腦室，注射5 min，留針5 min。)；D組：雷帕霉素組(造模前30 min腹腔注射雷帕霉素溶液10 mg/(kg·d)，取材前2.5 h再注射1次)；E組：LY294002組(腹腔注射LY294002溶液，方法用量同D組)；F組：中藥組。其中5只做TTC染色，5只做Western-Blot。ABCDE組于造模前連續7 d生理鹽水灌胃2.5 mL/d，F組同步連續7 d中藥灌胃2.5 mL/d。

2.2 模型復制

采用改進線栓法[4]復制大腦中動脈閉塞(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。將大鼠麻醉(按0.3 mL/100 g體質量，腹腔注射2%戊巴比妥鈉)，仰臥位固定，于頸部正中切口，分離右側頸總動脈(CCA)、頸內動脈(ICA)及頸外動脈(ECA)，切勿損傷血管及迷走神經。結扎CCA及ECA，順CCA經ICA將栓線送至顱內18 mm左右，阻斷大腦中動脈(MCA)血流，切記稍有阻力即停止進栓，避免蛛網膜下腔出血，縫合切口，留置線栓頭于體外。缺血2 h后行再灌注，抽提栓線至CCA內即可，通過Willis環側支循環實現再灌注(再灌注24 h)。Sham組只分離血管，不進行模型復制。

2.3 NSS評分

NSS(Neurological Severity Score)評分用于評價大鼠腦缺血再灌注24 h后神經功能損傷情況。得分由運動、感覺、平衡木及反射四項測試綜合評定，范圍0～18分，重度損傷：13～18分，中度損傷：7～12分，輕度損傷：1～6分。

2.4 TTC染色

將各組用于TTC染色的大鼠于冰盒上斷頭取腦，將腦組織于-20 ℃冰箱冷凍1 h。取出后，在冰盒上用刀片去除繡球和小腦，將大腦平均切成2 mm左右厚的5個薄片。將薄片放入PBS配制的0.4%TTC染液中，避光37 ℃染色10～15 min，翻動切片使其均勻著色。取出后按順序擺放，拍攝照片。

2.5 Western blot法檢測大腦組織PI3K，p-PI3K，Beclin-1蛋白表達水平

將再灌注24 h后凍存于-80 ℃的腦組織取出，研磨，加入含有1 mmol/L PMSF的Western及IP細胞裂解液進行裂解，低溫冷凍離心機11 000 r/min，4 ℃，離心5 min，取上清即大腦組織總蛋白樣品，用BCA 反應進行蛋白定量。5×Loading Buffer和PBS稀釋蛋白樣品，于沸水浴中煮沸5 min使蛋白充分變性。經SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉印于PVDF膜上，TBST緩沖液洗5 min，5%脫脂奶粉溶液封閉1 h(p-PI3K的封閉液、一抗孵育液、二抗孵育液為3 %BSA溶液)，分別加入一抗(Beclin-1稀釋比例1∶1 000，PI3Kp85稀釋比例1∶1 000，p-PI3Kp85稀釋比例1∶1 000)4 ℃孵育過夜，次日TBST漂洗5 min×4次，加入二抗(羊抗兔IgG-HRP稀釋比例1∶5 000)37 ℃孵育45 min，TBST漂洗5 min×6次。ECL化學發光試劑反應后，于暗室曝光。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 芪蛭膠囊對NSS神經功能評分的影響

與sham組比較，其余組均出現神經功能損傷癥狀，評分顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，雷帕霉素組、LY294002組、中藥組神經功能損傷癥狀改善，評分顯著降低(P<0.05)；與中藥組比較，LY294002組神經功能損傷較重(P<0.05)。分析可知，芪蛭膠囊對CIRI大鼠的神經功能起治療及保護作用，見表1。

表1 各組大鼠NSS神經功能評分情況

3.2 芪蛭膠囊對腦組織梗死體積百分比的影響

TTC染色后，使用Image-Pro Plus Analysis Software計算機圖像分析系統計算腦梗死體積，見圖1，表2。與sham組比較，其余組均出現明顯梗死灶(P<0.05)；與模型組比較，3-MA組、LY294002組腦梗加重，梗死體積進一步擴大(P<0.05)，同樣與模型組比較，雷帕霉素組、中藥組腦梗死減輕，梗死灶顯著縮小(P<0.05)；與中藥組比較，雷帕霉素組對CIRI大鼠的腦保護作用較弱，梗死體積較大(P<0.05)。對比分析可知，芪蛭膠囊可有效減輕CIRI大鼠腦梗死程度。

圖1 各組大鼠腦梗死面積比較

表2 各組大鼠腦梗死面積

3.3 芪蛭膠囊對大鼠腦組織Beclin-1，p-PI3K，PI3K蛋白表達的影響

將膠片進行掃描，用凝膠圖象處理系統(Gel-Pro-Analyzer軟件)分析目標條帶的光密度值。①Beclin-1：與sham組比較，其余組Beclin-1表達均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，3-MA組Beclin-1表達顯著降低(P<0.05)，雷帕霉素組、中藥組Beclin-1表達顯著升高(P<0.05)，見圖2，表3。②p-PI3K：與sham組比較，模型組、雷帕霉素組、LY294002組、中藥組p-PI3K表達顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，LY294002組、中藥組p-PI3K表達進一步降低(P<0.05)，見圖3，表3。③PI3K：與sham組比較，模型組、中藥組PI3K表達顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，3-MA組PI3K表達顯著升高(P<0.05)。見圖3，表3。可知，芪蛭膠囊可降低p-PI3K的表達，使Beclin-1高表達，從而進一步激活自噬。

注：A：sham組；B：模型組；C：3-MA組；D：雷帕霉素組；E：LY294002組；F：中藥組。圖2 Western blot法檢測各組腦組織Beclin-1蛋白表達比較

表3 各組腦組織PI3K、p-PI3K、Beclin-1蛋白表達的變化

4 討論

中風[5]之名首載于仲景《金匱要略·中風歷節病脈證并治第五》：“脈微而數，中風使然。”仲景認為中風病以正虛為本[6]因氣血不足，外邪誘發而致病，后清代醫家王清任提出“氣虛致瘀”的觀點，并且創立中風病傳世名方“補陽還五湯”，臨床效如桴鼓[7-8]。我課題組在總結梳理前人的經驗基礎上觀察研究臨床病例，認為本病的病因病機在臨床中以“氣虛血瘀夾痰”較為常見，氣虛為本，血瘀痰濁為標，血瘀痰濁痹阻腦絡而為病，擬定芪蛭膠囊經驗方劑。該方由黃芪、燙水蛭、丹參、地龍、石菖蒲、郁金、當歸等藥物組成，方中重用黃芪為君，補氣實表，逐邪祛風，治療中風，恰合本病“氣虛”之病機；針對本病“血瘀”的核心病機，伍用水蛭逐惡、逐瘀、破血、通絡，同樣取地龍破血逐瘀，通經活絡之效，丹參補血活血兼可祛瘀；石菖蒲、郁金二味，豁痰開竅配合活血化瘀之味，乃痰瘀同治之意，正對本病“夾痰”之病機。我課題組前期實驗研究發現[3,9-10]，該方能減輕腦水腫；保護腦組織神經元內線粒體形態及功能；提高腦組織SOD活性，減少MDA和NO的生成，清除過量自由基，對腦組織具有保護作用；可通過下調I/R大鼠腦組織PKC-MARCKS信號通路中MARCKS蛋白及mRNA的高表達，緩解CIRI。

近年來，自噬在腦缺血再灌注中發揮的重要作用逐步被認知。本次研究發現，使用自噬抑制劑3-MA[11]后相比模型組大鼠神經功能受損加重，腦梗死區域變大，說明自噬的發生對CIRI起拮抗作用。除抑制自噬外，本研究設雷帕霉素、LY294002組，分別抑制通路關鍵蛋白mTOR、PI3K從而激活細胞自噬，結果顯示，雷帕霉素進一步激活自噬可有效降低CIRI大鼠神經功能評分，對腦組織具有顯著保護作用，梗死體積顯著縮小，而LY294002組則未起到治療作用，究其原因，PI3K-Akt-mTOR信號通路并非線性存在，而是同時存在多種交叉對話及反饋機制[12]，抑制上游PI3K活性影響較大，自噬被過度激活，或可對實驗結果造成影響[12]，加重CIRI。相比之下，中藥組進一步適度激活自噬，在神經功能和腦組織保護方面均獲佳效。總之，自噬在I/R中發揮著雙向調節作用，適度自噬可保護缺血缺氧的腦組織，不足或過度的自噬則不能達到理想療效或進一步導致腦組織壞死[13-14]。

PI3K-Akt-mTOR信號通路是自噬經典通路，其中PI3K、Beclin-1是腦缺血再灌注損傷研究的常用指標，在自噬發生過程中不可或缺，對二者進行研究可進一步掌握自噬發生規律，更好應用自噬的雙向調節作用。Ⅰ型PI3K是由調節亞基p85和催化亞基p110構成的異源二聚體，PI3K靜息狀態下普遍存在于細胞質中[12]，其磷酸化形式p-PI3K被抑制，PI3K-Akt-mTOR信號通路被阻斷，則自噬被激活[15]。Beclin-1是哺乳動物自噬的特異性基因，是自噬效應的標志[16]，自噬前體和自噬體形成的必需分子[17]，自噬發生時其呈高表達，腦缺血后6 h即可增多，24 h達高峰，且至少持續48 h，是腦缺血再灌注損傷的重要指標[18]。本研究結果顯示，p-PI3K在I/R大鼠腦組織中表達降低，自噬激活，中藥組p-PI3K表達進一步顯著降低，說明自噬被進一步激活；同樣，Beclin-1在造模后表達增加，其表達量在中藥組最高，提示自噬被較大程度的激活。結合Western-blot結果與NSS評分及TTC染色結果，可知PI3K-Akt-mTOR信號通路介導的細胞自噬在CIRI中發揮重要調控作用，而芪蛭膠囊可調控PI3K-Akt-mTOR信號通路相關蛋白的表達，從而發揮拮抗CIRI的作用，有效保護缺血缺氧的腦組織細胞。

本研究進一步證實了芪蛭膠囊對CIRI的拮抗作用，通過對PI3K及Beclin-1在腦細胞表達情況的研究，明確了自噬在大鼠腦缺血再灌注中發揮的作用，且揭示了PI3K-Akt-mTOR信號通路關鍵蛋白PI3K對MCAO/R大鼠腦細胞自噬的調控作用，闡明了芪蛭膠囊拮抗CIRI的分子機制，為今后該病的防治及新藥的研發提供新靶點和新思路。