石斛多糖對SHR晚期糖基化終產物代謝變化及其與炎癥岡子的關系

陸積新 李近都 潘興壽 李天資 鄒才華 曾德創 梁燁

[摘要]目的 探討石斛多糖對自發性高血壓大鼠（SHR）炎癥因子和晚期糖基化終產物代謝的效果及其劑量。方法 提取石斛多糖，將SHR隨機分為對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組四組，對照組給開水，低劑量組、中劑量組和高劑量組分別給石斛多糖100、300、500mg/d，干預2個月，比較干預后各組腫瘤壞死因子（TNF-α），白細胞介素（IL）-6，IL-10，晚期糖基化終產物（AGE），可溶性AGE受體（sRAGE）和全長AGE受體（RAGE）mRNA水平。結果 與對照組比較，低劑量組TNF-α水平比較，差異有統計意義（P<0.05），中劑量組TNF-α、IL-6和IL-10水平差異有統計意義（P<0.05），高劑量組TNF-α、IL-6和IL-10水平差異有統計意義（P<0.05）。低劑量組sRAGE水平差異有統計意義（p<0.05），中劑量組sRA（-.E和RACE mRNA水平比較，差異有統計意義（P<0.05），高劑量組AGE、sRAGE和RAGE mRNA水平比較，差異有統計意義cP<0.05）。石斛多糖能夠有效緩解SHR的炎癥因子和晚期糖基化終產物代謝紊亂。其改善TNF-α、IL-6、IL-10、AGE、sRAGE和RAGE mRNA的作用有劑量效應關系，糾正SHR炎癥因子功能紊亂的有效劑量為300mg/d;糾正SHR晚期糖基化終末產物及其受體功能紊亂的有效劑量為500mg/d。結論 石斛多糖可有效緩解SHR的炎癥因子功能紊亂，降低AGE水平，提高sRAGE水平，降低RAGE基因的活化，對緩解SHR的血管重塑有積極的作用。其藥效有劑量效應關系，中等劑量可有效改善炎癥癥狀，高劑量能改善AGE及其受體癥狀。

[關鍵詞]石斛多糖;炎癥因子;晚期糖基化終產物;晚期糖基化終產物受體

[中圖分類號]R285.5

[文獻標識碼]A

[文章編號]2095-0616（2020）01-09-05

晚期糖基化終末產物（advanced glycationendproducts，AGE）能夠和身體的組織細胞相組合，導致慢性退化型疾病的發生，是全球醫學界最為熱門的領域之一，AGE受體（receptor for advancedglycation end-product，RAGE）是細胞表面分子的免疫球蛋白超家族成員之一，與AGE及蛋白質分子相互作用參與炎癥反應，高水平的AGE可促進RAGE的表達，誘導細胞信號轉導與促進AS的發生和發展有關[1]?？扇苄訰AGE（soluble receptor foradvanced glycationend products， sRAGE） 與RAGE結構相似，可競爭性地與AGE結合，對保護血管細胞，改善AS進程有積極的作用，成為臨床藥學關注的熱點[2]。石斛（dendrobium）含有豐富的酚類、類萜類和含氮類等重要藥用成分，具有滋陰清熱，抑制炎癥反應，增強免疫力等功效，在AS中發揮了積極的作用，但其作用的靶點及其機制還不完全清楚[3]。為探討石斛對AS的療效及其機制，本研究觀察石斛多糖干預SHR后其腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細胞介素（IL）-6、IL-10、AGE、sRAGE和腹主動脈平滑肌RAGE mRNA表達水平的變異情況。

1 材料與方法

1.1鐵皮石斛多糖

采用人工栽培鐵皮石斛（廣西根遼生物技術有限公司提供），經本校何思陸主任藥師鑒定為鐵皮石斛（Dendrobium candidum）。鐵皮石斛多糖提取按文獻[4]：取新鮮品鐵皮石斛莖1000g，100℃殺青30min，60℃烘箱烘干24h，100目粉碎機粉碎，80℃熱水浸提2h，離心、抽濾、濃縮至原有體積的1/6，醇沉24h，離心，真空干燥。熱水回流加纖維素酶（Cellulase）純化，水浴加熱濃縮至含生藥量為1g/100mL的藥液，殺菌，貯存于4℃冰箱內備用。

1.2動物喂養與藥飼

（1）自發性高血壓大鼠（SHR）和飼料：SHR由中山大學北校園實驗動物巾心提供，動物合格證號：SYXK（粵）2017-0081。選購2個月±2d齡雄性SHR大鼠48只，普通級。鼠飼料丸由上海新奇特種飼料廠提供。（2）喂養方法：鼠飼料丸架式籠養，室溫（20±2）℃，相對濕度（75±5）%，光照明暗各12h交替，喂養至8個月±2d月齡，平均體重為（352+5）g時給予藥物干預。（3）分組藥飼：將48只SHR大鼠隨機分為對照組、低劑量組、巾劑量組和高劑量組四組，每組12只共一籠飼養。（4）藥物劑量：根據2010年版《中國藥典》成人70kg推薦劑量10g/d，SHR體重0.35kg，按照人用量推算動物給藥量，SHR等效劑量約為人的6.3倍，本研究用石斛劑量為：低劑量組100mg/d，中劑量組300mg/d，高劑量組500mg/d。（5）給藥方法：低劑量組口腔給石斛多糖藥飲100mg/d（取10.0mL藥液加水40mL）;巾劑量組口腔給石斛多糖藥飲300mg/d（取30.0mL藥液加水10mL）;高劑量組口腔給石斛多糖藥飲500mg/d（取50.0mL藥液），每天1次。對照組口腔給開水50.0mL/d。四組均等量喂鼠飼料丸，飲用水自由飲用，連續2個月。

1.3標本采集

于干預后麻醉SHR進行標本采集。（1）麻醉方法：碘伏消毒，以10%水合氯醛3mL/kg腹腔注射麻醉大鼠。（2）血液標本采集：剃去腹部的毛，解剖，切腹壁打開腹腔，從腹腔靜脈取血0.5mL，低溫分離取血清。（3）標本采集：剪取腹主動脈平滑肌15mm×3mm組織，剪成5mm×3mm共3小塊，分別置于3個凍存管，于30min內液氮固定4h，移至-70℃冰箱保存備檢。

1.4標本檢測

TNF-α、IL-6、IL-10和sRAGE測定用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法，試劑盒由杭州沃森生物技術有限公司提供，用美國BIO RAD 550型酶標儀檢測，嚴格按檢測方法和程序進行。

1.5RAGE mRNA表達檢測

用RT-PCR法，取100μL腹肌勻漿，用Trizol試劑提取總RNA，氯仿和異丙醇抽提。紫外分光光度儀和瓊脂糖電泳鑒定RNA的濃度和純度，取10μL，逆轉錄合成cDNA，-70℃凍存備用。取5μL逆轉錄產物進行PCR擴增反應，并以β-actin為內參對照。根據Gene Bank人類RAGE基因（Gene Bank登錄號AB036432）設計RAGE基因引物，由杭州聯川生物技術有限公司設計合成。RAGE基因序列為F：5'一GGGGTACCAAGGAAGCAGGTAGGCAGCC-3';R：5'-CCGCTCGAATCCATTCCTGTTCATCTGC-3'，擴增長度328bp。管家基因序列為F：5'-TCCTAGCACCATGAAGATC-3';R：5'一AAACGCAGCTCAGTAACAG-3'，擴增長度225bp。PCR反應條件：55℃逆轉錄反應60min，94℃變性2min→94℃30s→55℃30s→72℃1min，共30循環，72℃延伸7min。膠回收試劑盒回收目的基因片段。PCR產物在瓊脂糖凝膠巾電泳，凝膠成像儀采集圖像，PCR儀獲得產物Ct值，采用2-△△Ct相對定量計算公式計算分析。

1.6統計學分析

應用SPSS20.0版本軟件進行統計處理，計量資料以（χ±s）表示。兩組資料比較采用獨立樣本t檢驗，多組資料比較采用單因素方差分析，組間比較用LSD檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1石斛多糖對SHR血清TNF-α、IL-6和IL-10水平的影響

與對照組比較，低劑量組TNF-α水平差異有統計意義（P<0.01），巾劑量組TNF-α、IL-6和IL-10水平差異有統計學意義（P<0.01或P<0.05），高劑量組TNF-α、IL-6和IL-10水平差異有統計學意義（P<0.01）。與低劑量組比較，巾劑量組TNF-α水平差異有統計學意義（P<0.01），高劑量組TNF-α、IL-6和IL-10水平差異有統計學意義（P<0.01或P<0.05）。與巾劑量比較，高劑量組TNF-α和IL-6水平差異有統計學意義（P<0.01）。提示石斛多糖能有效糾正炎癥功能紊亂，表現為降低TNF-α和IL-10水平，提高IL-6水平，治療SHR炎癥因子的有效劑量為石斛多糖300mg/d，連用2個月。將劑量提高到500mg/d，其糾正炎癥功能紊亂效果差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2石斛多糖對SHR血清AGE、sRAGE水平和動脈平滑肌組織RAGE mRNA表達的影響

與對照組比較，低劑量組sRAGE水平差異有統計學意義（P<0.01），中劑量組sRAGE和RAGE mRNA水平差異有統計學意義（P<0.01或P<0.05），高劑量組AGE、sRAGE和RAGE mRNA水平差異有統計學意義（P<0.01）。與低劑量組比較，巾劑量組sRAGE水平差異有統計學意義（P<0.01），高劑量組AGE、sRAGE和RAGE mRNA水平差異有統計學意義（P<0.01）。與巾劑量組比較，高劑量組AGE、sRAGE和RAGE mRNA水平差異有統計學意義（P<0.01）。提示石斛多糖能有效糾正晚期糖基化終末產物及其受體功能紊亂，表現為提高sRAGE水平，降低AGE和RAGE mRNA水平。石斛多糖有效糾正SHR AGE及其受體功能紊亂的有效劑量為500mg/d，連用2個月。見表2。

3 討論

有關糖基化產物（AGE）及其特異性受體（RAGE）的結構及其對各種疾病病理機制作用的共識正在不斷更新，AGE是一種對機體有害的高度活性的羰基化合物，營養物質經過美拉德（Maillard）反應產生的終末產物，AGE在非酶促條件下，營養物質中的蛋白質、氨基酸、脂類或核酸等大分子游離的氨基與還原糖的醛基經過縮合、重排、裂解、氧化修飾后等美拉德反應產生的，首先大分子末端的還原性氨基與還原糖分子中的醛基發生加成反應，形成希夫堿（Schiff bases），其次希夫堿再發生阿馬道里（Amadori）重排，形成早期糖基化產物醛胺類，再次醛胺類再經過脫水，重排反應生成乙二酸（草酸），3-脫氧葡萄糖醛酮（3-DG）和甲基乙二醛（丙酮醛）等AGE[5]。體內AGE的主要來源一是食物中存在通過進食將AGE攝入體內，另外當體內葡萄糖濃度異常增高時，體內AGE的合成加速，分解減緩[6]。當AGE異常增高時，細胞表面的RAGE與AGE配體相互作用產生效應，導致許多慢性退化型疾病的發生[7]。人類RAGE編碼基因位于6號染色體上，包含11個外顯子和10個較短的內含子[8]。RAGE是一類模式識別受體，正常情況下RAGE表達量很低，當機體出現AGE聚集，RAGE表達量上調，激活如磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol3 kinase，PI3K）、分裂原激活的蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases.MAPK）、應激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase，SAPK）、信號傳導及轉錄激活因子（signal transducers and activatorsof transcription，STAT）等多種信號傳導通路的級聯放大反應，激活下游核轉錄因子（NK-K B）等，調節多種基因的轉錄表達，炎癥因子釋放，導致血管通透性增高，單核細胞粘附，基質成分增多等病理變化，在動脈粥樣硬化損傷的發生發展巾發生作用[9]。研究認為，AGE與RAGE配體結合后，RAGE將信號傳遞至胞內，從而引發由氧自由基、蛋白酪氨酸激酶、蛋白激酶C、細胞外信號調節激酶、p38絲裂原蛋白激酶和NF-KB等構成的信號轉導途徑[10]。雖然AGE與RAGE配體結合后RAGE首先與哪種蛋白結合，目前還不完全清楚，但對RAGE多聚核糖體mRNA研究發現，RAGE有3種主要的剪接變異體，分別為全長膜結合型（RAGE）、截去C端可溶型（sRAGE）和截去N端膜結合型。RAGE有完整的胞外段、膜鑲嵌區和胞內段;sRAGE為RAGE的胞外段部分，缺少跨膜鑲嵌區和胞內段;膜結合型僅有膜鑲嵌區和胞內段，沒有胞外段部分[11]。因此只有RAGE和sRAGE能與配體結合，膜結合型由于缺失胞外段不能與配體結合。而sRAGE缺少跨膜鑲嵌區和胞內段，其AGE配體結合后，信號不能傳遞至胞內，不會發生信號傳導通路的級聯放大反應，同時sRAGE可與RAGE競爭結合其配體，對機體的多種病理狀態起到保護作用[12]。降低AGE，阻斷RAGE表達量上調，刺激機體產生更多的sRAGE等，被認為是緩解氧化應激，預防動脈粥樣硬化及其并發癥的方向標[13]。腫瘤壞死因子超家族和白細胞介素是重要細胞因子之一，其通過免疫原、絲裂原等刺激劑誘導產生并通過旁分泌、自分泌或內分泌等方式在靶器官巾發揮作用，機體在遭受各種有害刺激時，致病因子TNF-α，IL-10產生過多，保護因子IL-6受抑，促進動脈粥樣硬化損傷[14]。祖國醫學認為風寒暑濕燥火等從經絡傳人臟腑，導致痰濁、血瘀、痰瘀交阻是糖基化產物代謝紊亂慢性血管疾病的病機，是“痰濁”辨證的客觀表現，早在東漢時期，張仲景在《金匱要略》巾描述石斛具有益氣健脾，理氣活血，補脾益陽等功效，是溫陽健脾的重要代表方劑，現代藥理學認為石斛多糖有抗炎、抗病毒、調節免疫功能、清除自由基等作用[15]。本研究結果顯示，用石斛多糖干預自發性高血壓大鼠，可明顯增高其IL-6和sRAGE水平，降低其TNF-α，IL-10，AGE及RAGE mRNA水平。提示石斛多糖可能通過降低AGE生成和積累，提高sRAGE表達，抑制RAGE活化，改善SHR大鼠炎癥功能紊亂狀態，在SHR的血管損害病理過程中起到保護性作用。中醫認為動脈粥樣硬化性疾病本為陰陽失調，標為內生之風、痰濁和瘀血。治療上應當用活血化瘀，行氣通絡，豁痰利氣等[16-22]。本研究結果提示，石斛多糖可有效緩解SHR的炎癥反應和晚期糖基化終末產物及其受體功能紊亂狀況。石斛多糖對改善SHR的癥狀有劑量效應關系，改善炎癥癥狀巾等劑量，改善晚期糖基化終產物及其受體癥狀的劑量比較高。石斛多糖為治療血管重塑提供新型的空間。

[參考文獻]

[1]何思陸，李天資.FXYD5在高血壓病動脈粥樣硬化中調控機制的研究進展[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2015. 13（15）：1730-1732.

[2]Yamamoto KI， Murata H.Signal Diversity of Receptor forAdvanced Glycation End Products[J].Acta Med Okayama，2017. 71（6）：459-465.

[3]曾德創，鄒才華，李近都，等.石斛治療血栓閉塞性脈管炎患者炎癥細胞因子變化的觀察[J].中國醫藥科學，2016，6（21）：9-12，17.

[4]黃曉君，聶少平，王玉婷，等.鐵皮石斛多糖提取工藝優化及其成分分析[J]，食品科學，2013，34（22）：21-26.

[5]Klont F，Pouwels SD， Hermans J，et al.A fully validatedliquid chromatography-mass spectrometry method forthe quantification of the soluble receptor of advancedglycation end-products（sRAGE）：in serum usingimmunopurification in a 96-well plate format[J].Talanta.2018. 182（1）：414-421.

[6]Kolliker Frers RA， Cosentino V， Tau J，et al.lmmune-mediated inflammation promotes subclinical atherosclerosisin recent-onset psoriatic arthritis patients withoutconventional cardiovascular risk factors[J].Front Immunol，2018，9：139.

[7]Ritarwan K， Lelo A， Pane YS， et al.lncreasingatherosclerosis in streptozotocin-induced diabetes into fourgroups of mice[J].Open Access Maced J Med Sci， 2018，6（2）：287-292.

[8]劉言鳳，余文珍，施紅.石斛合劑對H202誘導SH-SY5Y細胞損傷的保護作用[J].中華中醫藥雜志，2016，31（10）：4271-4274.

[9]Mirlohi MS， Yaghooti H， Shirali S，et al.lncreased levelsof advanced glycation end products positively correlatewith iron overload and oxidative stress markers in patientswith β -thalassemia major[J].Ann Hematol， 2018， 97（4）：679-684.

[10]Murakami Y， Fujino T，Hasegawa T，et aI.Receptor foradvanced glycation end products（RAGE）：-mediatedcytotoxicity of 3-hydroxypyridinium derivatives[J].BiosciBiotechnol Biochem， 2018， 82（2）：312-319.

[11]梁燁，鄒才華，李近都，等.石斛藥用次生代謝產物及其基因克隆研究進展[J].中華中醫藥雜志，2018，33（12）：5511-5514.

[12]Gasparotto J，Girardi CS， Somensi N，et aI.Receptorfor advanced glycation end products mediates sepsis-triggered amyloid-p accumulation， Tau phosphorylation，and cognitive impairment[J].J Biol Chem， 2018， 293（1）：226-244.

[13]李俊峰，劉文洪，張貝貝，等.鐵皮石斛內生菌的分離及代謝產物活性的初步研究[J].中華中醫藥雜志，2016，31（3）：970-974.

[14]黃元東，潘興壽，梁燁，等.鐵皮石斛對急性有機磷農藥中毒患者解毒及其抗免疫的療效觀察[J].中國地方病防治雜志，2014，29（S2）： 204.

[15]曾德創，鄒才華，李近都，等.血管重建術治療血栓閉塞性脈管炎患者的療效觀察[J].右江醫學，2017，45（2）： 134-137.

[16]潘興壽，梁燁，李天資，等.野芭蕉輔助治療高血壓伴穩定勞力型心絞痛PCI術后患者炎癥反應療效觀察[J].時珍國醫國藥，2014，25（9）：2171-2173.

[17]李鴻翔，梁燁，李天資，等.原發性高血壓危險因素的易感基因及其非編碼RNA研究進展[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2014，12（7）： 879-881.

[18]陸高翔，韋華，李天資，等.解痙通絡活血治療高血壓病患者炎癥因子變化的臨床研究[J].遼寧中醫雜志，2009， 36（8）：1306-1308.

[19]梁燁，李天資，陸高翔，等.野芭蕉治療自發性高血壓大鼠療效機理的實驗研究[J].時珍國醫國藥，2013，24（10）：2324-2326.

[20]潘小炎，李天資，周喜漢，等.石斛治療實驗性大鼠萎縮性胃炎的醫學研究[J].右江醫學，2009，37（1）：1-3.

[21]李天資，梁燁，陸高翔，等.野芭蕉治療高血壓頸動脈斑塊陽性患者療效機制的臨床研究[J].時珍國醫國藥，2012， 23（9）：2259-2260.

[22]Birgin E，Gebhardt C，Hetjens S，et al.ExtracorporalShock Wave Therapy Enhances Receptor for AdvancedGlycated End-Product-Dependent Flap Survival andAngiogenesis[J].Ann Plast Surg， 2018， 80（4）：424-431.

（收稿日期：2019-04-09）

[基金項目]國家自然科學基金（81060028）;廣西重大專項基金（桂科重1598005-9，桂科攻1355005-3-7）;廣西衛生基金（GXZC1242）。

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