MicroRNA-454-3p通過靶向VGLL4促進肝細胞癌的生長

陳建清 陶元平 楊遠 胡良凱△

(1.上海市楊浦區市東醫院消化內科，上海 200438；2.海軍軍醫大學第三附屬醫院肝外三科，上海 200433)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一,由于缺乏早期診斷標志物和有效的治療靶點，大部分患者預后較差[1]。因此探索研究導致HCC發生發展的分子機制，尋找新的有效治療靶點尤為重要。microRNAs(miRNAs)是一類單鏈非編碼RNA分子，通過與靶基因互補的序列結合抑制其翻譯過程或者直接降解mRNA，從而在轉錄后調控基因的表達[2-3]。越來越多的證據表明，miRNAs在多種腫瘤的發生和發展過程中發揮著重要作用[4-5]。miRNA-454-3p在各種類型的癌癥中發揮抑癌或致癌基因的作用。然而，miR-454-3p在HCC的生物學作用和分子機制的研究仍然非常有限。因此，本研究將深入探討miR-454-3p在肝細胞癌進展中的作用和相應的分子學機制。

1 材料與方法

1.1組織標本 本研究選取2010年1月1日至2013年12月31日于海軍軍醫大學附屬東方肝膽外科醫院手術切取及病理確診為原發性肝癌的患者，取其肝癌組織及相應癌旁組織(距離癌灶>5cm)各75例。所有患者HBsAg均陽性，術前均未行放化療或靶向治療，平均年齡(56.1±11.3)歲，其中男性60例，女性15例；血甲胎蛋白(AFP)水平>400 ng/mL 41例；腫瘤直徑>5 cm 41例；BCLC分期A期25例、B期50例、C期 0 例。患者臨床資料在醫院病案室查得，術前均未接受過放、化療治療。本研究經海軍軍醫大學附屬東方肝膽外科醫院倫理委員會批準。患者對本研究均知情同意。

1.2主要材料 肝癌細胞系(Huh-7、HepG2、MHCC-97H、HCCLM3、SMMC-7721)、正常肝上皮細胞系(LO2)和HEK-293T細胞均購自上海科學院細胞庫。DMEM/F12細胞培養基購自美國Hyclone公司；特級澳洲胎牛血清和0.25% EDTA-胰蛋白酶購自美國Gibco公司；限制性內切酶Xho I、EcoR I、轉染試劑Lipofectamine 2000、TRIzol、4×SDS loading buffer(Invitrogen)和逆轉錄試劑盒，SYBR Green試劑盒和RNAase free water均購自日本TaKaRa公司；miR-454-3p模擬物、miR-454-3p抑制劑和VGLL4過表達慢病毒購自上海吉瑪公司；SDS-PAGE凝膠配置試劑盒購自廣州碧云天公司；VGLL4抗體和GAPDH 抗體購自美國Abcam公司；BCA 蛋白定量試劑盒購和蛋白Marker自美國Thermo公司；ECL發光液購自美國Millipore公司；PVDF膜購自美國Whatman公司；Transwell小室購自美國Corning公司，實驗所用引物由上海生工公司合成，其他生化試劑均為進口分裝或國產分析純。

1.3方法

1.3.1細胞轉染 肝癌細胞系(Huh-7、HepG2、MHCC-97H、HCCLM3、SMMC-7721)、正常肝上皮細胞系(LO2)和HEK-293T細胞復蘇后，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基培養，置37℃、5% CO2、飽和濕度的恒溫孵箱中培養。當細胞融合度大約為80%時用胰酶消化傳代。將對數生長期HepG2和 SMMC7721細胞種植于6孔培養板中(每孔大約1×105細胞)，第2天觀察細胞融合度大約為50%并開始進行轉染。miR-454-3p模擬物(miR-454-3p mimic)和miR-control、miR-454-3p抑制劑(miR-454-3p inhibitor)和miR-NC、VGLL4過表達慢病毒以及對照組(NC) 購自上海吉瑪制藥技術有限公司。VGLL4野生型3’-UTR 和突變型3’-UTR 由上海吉瑪制藥技術有限公司合成并連接到psi-CHECK-2載體。采用Lipofectamine2000分別轉染，轉染步驟參照Invitrogen說明書。

1.3.2qRT-PCR檢測 收集組織和肝癌細胞系(Huh-7、HepG2、MHCC-97H、HCCLM3、SMMC-7721)、正常肝上皮細胞系(LO2)樣品，加入1 mL Trizol提取液提取細胞總RNA。頸環法反轉錄得到cDNA，取1 μL cDNA樣品用于miR-454-3p或VGLL4檢測；SYBR Green 法進行PCR檢測。miR-454-3p及內參U6、VGLL4及內參GAPDH PCR引物購自廣州銳博生物科技有限公司，PCR 擴增條件為：94℃預變性5 min，然后94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min 30 s進行40個循環。每個樣重復3次。引物如下：miR-454-3p：正向5’-ACCCTATCAATATTGTCTCTGC-3’，反向5’-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3’；U6：正向5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；VGLL4：正向5’-CTCGCACTGACCAAGAACAG-3’，反向5’-TGCGAGAGGTTGCAGTTG-3’；GAPDH：正向5’-CAGGGCTGCTTTTAACTCTGGT-3’，反向5’-GATTTTGGAGGGATCTCGCT-3’。分別以GAPDH和U6作為mRNA和miRNA的內參基因。用2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達水平。

1.3.3蛋白質印跡法 向收集處理好的各組肝癌細胞，加入RIPA蛋白裂解液，冰上裂解，于4℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清進行蛋白質定量后分裝，加入4×上樣緩沖液，70℃加熱10 min使蛋白質變性，然后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。用PVDF膜轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，用相應的抗體anti-VGLL4(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。TBST洗膜，加入二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h。ECL發光試劑盒顯影，以GAPDH(1∶5 000)為內參照，掃描灰度值并分析蛋白表達相對含量。

1.3.4MTT比色實驗 將miR-454-3p mimic轉染至HepG2細胞、miR-454-3p inhibitor轉染至SMMC-7721細胞，培養48 h后，將處于對數生長期的各組細胞胰酶消化，制成細胞懸液，接種至96孔板(2×l03/孔)中。培養24，48，72，96 h后，加入20 μL 5 g/L MTT，孵育4 h后離心去掉上清，加入DMSO 150 μL溶解結晶，測定吸光度A450nm。

1.3.5侵襲試驗 將Transwell侵襲小室置入24孔板中，在Transwell小室的下室加入含10% FBS的DMEM高糖培養液，收集轉染后的各組細胞重懸，加入200 μL重懸液共2×104細胞到Transwell小室的上室，其余操作步驟依參考文獻進行[6]。

1.3.6基因分析 miR-454-3p使用預測軟件Targetscan(http://www.targetscan.org)進行靶基因預測。為了確定VGLL4 mRNA的3’-UTR 是否為miR-454-3p的直接靶蛋白，VGLL4 mRNA的野生型全長3'-UTR及突變型3’-UTR擴增并連接到psi-CHECK-2載體(Promega，美國)，分別命名為3’-UTR -VGLL4-WT和3’-UTR -VGLL4-MUT。HEK-293T細胞共轉染200 nmol/L miR-NC或者miR-454-3p模擬物和100 ng質粒(3’-UTR-VGLL4-WT或3’-UTR-VGLL4-MUT)，24孔板培養48 h。收集細胞裂解，Renilla和firefly熒光素酶熒光強度使用Dual-Luciferase報告分析系統(Promega)進行分析。

1.4統計學方法 采用SPSS 18.0版進行統計分析。miR-454-3p在肝癌和癌旁組織中表達情況的比較采用配對樣本的t檢驗; 不同組間細胞侵襲數的比較采用兩獨立樣本的t檢驗或單因素方差分析和LSD-t檢驗；兩組間細胞增殖能力的比較采用2×5析因設計的方差分析；皮爾森相關系數分析miR-454-3p和VGLL4相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1miR-454-3p在肝癌組織和肝癌細胞系中表達上調 qRT-PCR結果提示，與癌旁組織(0.223 ±0.017)相比,miR-454-3p在肝癌組(0.145±0.010)的相對表達量上調(圖1A)。采用同樣的試驗方法檢測miR-454-3p在細胞中的表達水平，qRT-PCR結果發現LO2、SMMC-7721、MHCC-97H、HCCLM3、Huh-7和HepG2細胞中miR-454-3p的相對表達量為(1.000±0.029)，(5.542 ±0.418)，(4.538 ±0.979)，(3.993 ±0.484)，(3.274 ±0.331) 和(2.060 ±0.080)。和人正常肝細胞系LO2相比，肝癌細胞系SMMC-7721、MHCC-97H、HCCLM3、Huh-7和HepG2細胞中miR-454-3p的表達上調，差異顯著具有統計學意義(圖1B)。

2.2miR-454-3p促進肝癌細胞的增殖和侵襲能力 qRT-PCR檢測結果顯示，miR-454-3p在HepG2細胞中的表達miR-454-3p mimic組于control組相比，上調10.280倍，差異有統計學意義(P<0.001);在SMMC-7721細胞中miR-454-3p inhibitor組于miR-NC組相比，下調5.128倍，差異具有統計學意義(P<0.001)。結果證明miR-454-3p模擬物和抑制劑轉染成功(圖2A)。MTT結果顯示，過表達miR-454-3p后，HepG2細胞的增殖能力增強，與control組相比，在72 h和96 h差異均有統計學意義(P<0.01)；相反的，抑制miR-454-3p后,SMMC-7721細胞的增殖能力減弱，與miR-NC組相比,在72 h和96 h差異均具有統計學意義(P<0.01、P<0.001)(圖2B)。在HepG2細胞中miR-454-3p mimic組和control組的侵襲細胞數分別(279±11)和(185±5)。在SMMC-7721細胞中miR-454-3p inhibitor組和miR-NC組的侵襲細胞數分別(251±13)和(140±13)。結果表明，miR-454-3p上調可顯著增強HepG2細胞的侵襲能力。相比之下，miR-454-3p下調降低了SMMC-7721細胞的侵襲能力(圖2C)。

2.3VGLL4是miR-445-3p的直接靶基因 如圖3A所示，qRT-PCR檢測發現VGLL4的mRNA表達在HepG2細胞中miR-454-3p mimic組于control組相比，下調5.128倍，差異有統計學意義(P<0.001);在SMMC-7721細胞中miR-454-3p inhibitor組于miR-NC組相比，上調5.667倍，差異有統計學意義(P<0.001)。Western blot檢測發現VGLL4的蛋白的表達趨勢和mRNA一致(圖3B)。為了證明VGLL4是否為miR-454-3p的靶基因，采用雙熒光素酶報告基因檢測(圖3C)。VGLL4-WT+control組和VGLL4-WT+ miR-454-3p mimic組的熒光活性變化倍數分別為(1.108±0.070)和(0.383±0.017)，差異有統計學意義(P<0.01)。VGLL4-MUT+control組及VGLL4-MUT+miR-454-3p mimic組的熒光活性變化倍數分別為(1.139±0.083)和(1.060±0.101)，差異無統計學意義(P>0.05)。利用qRT-PCR技術檢測HCC組織和對應癌旁組織中VGLL4的mRNA表達情況，以GAPDH為內參基因，結果提示，與癌旁組織(0.264±0.016)相比,VGLL4在肝癌組(0.176±0.011)的相對表達量降低(圖3E)。皮爾森相關系數分析提示，在75例HCC組織中miR-454-3p和VGLL4 mRNA表達成負相關(圖3F)。

2.4上調VGLL4表達抵消了miR-454-3p促進肝癌細胞增殖和轉移的能力 MTT結果顯示，miR-454-3p mimic +VGLL4組與control組相比，在24，48，72，96 h差異無統計學意義。侵襲實驗研究顯示，在HepG2細胞中miR-454-3p mimic +VGLL4組和control組的侵襲細胞數分別(175±2)和(179±5)，差異無統計學意義(P>0.05)。以上數據表明miR-454-3p可通過調節VGLL4的表達而發揮促進肝癌細胞增殖和轉移的能力(圖4A～C)。

3 討 論

在本研究中，我們闡明了miRNA-454-3p在促進HCC進展中的關鍵作用的新機制。我們發現，miRNA-454-3p在肝癌組織和細胞中的表達顯著上調。我們還觀察到miR-454-3p處理可增強肝癌細胞的增殖和侵襲能力，而敲除miR-454-3p的表達則產生相反的結果。此外，我們的研究表明VGLL4是miR-454-3p的直接靶向，本研究提示miR-454-3p在肝癌的發病機制中發揮著重要作用。

VGLL蛋白在哺乳動物中有4種亞型，依次命名為VGLL1-4，近期研究發現VGLL蛋白通過與TEAD相互作用在腫瘤的發生和發展中發揮著重要作用[7]。其中，VGLL4攜帶兩個于TEAD相互作用的TDU域。VGLL4可以通過不同的分子信號通路抑制腫瘤的發生和發展，例；VGLL4可通過負性調節凋亡蛋白抑制劑(IAPs)來促進細胞凋亡[8]。VGLL4在多種腫瘤和癌癥中發揮抑癌基因的作用[9-13],低表達的VGLL4通常預示患者預后較差。在肺癌中的腫瘤組織中VGLL4的表達明顯低于對應的癌旁組織,VGLL4和TEAD4之間的交互作用抑制了YAP介導的相關靶基因的表達從而抑制了肺癌細胞的增殖能力[14]。在乳腺癌中，VGLL4同樣通過與YAP結合，進而抑制YAP下游基因來發揮抑制腫瘤的作用[15]。在胃癌中,VGLL4可以提高E-cadherin蛋白的表達水平同時降低β-catenin蛋白表達水平[16]。最新研究證實過表達VGLL4可以抵消MicroRNA-301a-3p 促進肝癌細胞增殖和轉移的能力。在本研究中，通過熒光素酶報告分析證實VGLL4是miR-454-3p的直接靶向。與此同時，VGLL4的mRNA和蛋白水平與miR-454-3p在肝癌細胞中的表達呈負相關。此外，細胞功能學試驗證實過表達miR-454-3p可促進肝癌細胞的增殖和侵襲。然而，過表達VGLL4可以抵消miR-454-3p促進肝癌細胞的增殖和侵襲的能力。這些結果表明miR-454-3p通過調節VGLL4的表達促進細胞增殖和侵襲。

綜上所述，我們證明miR-454-3p在肝癌組織中的上調表達，細胞功能學試驗證實miR-454-3p促進肝癌細胞的增殖和侵襲。本研究首次證明VGLL4是miR-454-3p的直接靶向。該研究為肝癌的治療提供新的靶點和思路。

(本文圖1～4見封三)