胃癌中HSDL2過表達與臨床病理特征的相關性

董 兵，樸俊杰,2，楊 洋,2，朱 光，秦云植，林貞花,2

胃癌是我國第二大常見腫瘤[1]，其侵襲性強、惡性程度高，患者5年生存率僅為10%[2-3]。胃癌的發生、發展是一個長期的、多階段、多因素共同參與的過程，如環境因素引起的幽門螺旋桿菌感染等[4]。隨著蛋白組學和基因組學的飛速發展，血清CEA、CA19-9、CA72-4等大量生物學標志物的發現提高胃癌的早期診斷，但這些標志物仍存在特異性低和敏感性差等問題亟待解決[5-6]。

人類羥基類固醇脫氫酶樣蛋白2(hydroxysteroid dehydrogenase like 2, HSDL2)是短鏈脫氫酶/還原酶(SDR)超家族的成員之一[7]。HSDL2在人體組織中廣泛表達，尤其在肝臟、腎臟及前列腺中的表達水平較高。研究顯示，HSDL2異常表達與細胞的惡性轉化密切相關，可參與乳腺癌、卵巢癌的發生、發展[8-9]，目前HSDL2在胃癌中的表達及作用尚未見報道。本文旨在探討HSDL2蛋白在胃癌中的表達，并分析HSDL2過表達與胃癌臨床病理特征及預后的關系。

1 材料與方法

1.1 材料收集2003年10月～2015年10月延邊大學腫瘤研究中心存檔的胃癌組織標本90例、正常胃組織標本20例(部分組織標本購自上海芯超公司)，患者臨床病理資料均完整。所有組織均經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋。90例胃癌患者中男性65例，女性25例；年齡<50歲者19例，≥50歲者71例；腫瘤直徑≤5.0 cm者55例，>5.0 cm者35例；有淋巴結轉移23例，無淋巴結轉移67例；高分化4例，中分化50例，低分化36例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期20例，Ⅲ+Ⅳ期70例。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 采用免疫組化SP兩步法檢測HSDL2蛋白的表達，HSDL2兔抗人多克隆抗體購自美國Proteintech公司(15631-1-AP)。染色步驟：組織4 μm厚連續切片，常規脫蠟，梯度乙醇水化，熱檸檬酸鹽緩沖液中抗原修復，滴加一抗HSDL2(稀釋比1 ∶100)，4 ℃孵育過夜。次日辣根過氧化物酶標記二抗，DAB顯色，Mayer蘇木精復染，中性樹膠封固。為證明HSDL2抗體免疫組化的特異性，選用HSDL2蛋白強陽性染色的切片，以PBS代替一抗作為陰性對照。采用UALCAN數據庫分析胃癌及正常組織中HSDL2 mRNA的表達水平。

1.2.2免疫熒光 免疫熒光染色用于檢測HSDL2在SGC-7901和AGS胃癌細胞中的定位。當SGC-7901、AGS細胞在蓋玻片上生長融合至70%～80%時，經4%多聚甲醛固定。使用0.5%TritonX-100透化細胞后，3%牛血清白蛋白V(A8020，北京索萊寶公司)封閉。滴加一抗HSDL2(稀釋比1 ∶100)，4 ℃孵育過夜。滴加Alexa Fluor 488孵育山羊抗兔IgG(H+C)(A11008，1 ∶1 000，Invitrogen公司)室溫孵育1 h。PBS洗滌后，DAPI染色(C1006，上海碧云天生物公司)，蓋玻片封固。IF信號可視化，并用BX53 Olympus顯微鏡記錄。

1.3 結果判斷根據Beesley分級法，HSDL2蛋白以細胞質呈棕褐色顆粒為陽性。根據細胞染色強度計分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。根據陽性細胞百分比計分：陽性細胞數占0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。將兩項得分結果相乘：0分為(-)，1～4分為(+)，5～8分為()，9～12分為()；其中≤4分為HSDL2低表達，>4分為HSDL2高表達。

1.4 數據庫分析通過UALCAN數據庫分析HSDL2 mRNA表達水平，通過GEPIA數據庫分析HSDL2表達與患者生存期的關系。

1.5 統計學分析所有數據采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。各組間陽性率差異的比較及與臨床病理特征之間的關系采用χ2檢驗及P值修正。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HSDL2蛋白在胃癌細胞SGC-7901和AGS中的表達為確定HSDL2的亞細胞定位，分別在SGC-7901和AGS胃癌細胞中進行HSDL2蛋白的免疫熒光檢測。結果顯示：HSDL2的強陽性信號主要定位于胃癌細胞SGC-7901和AGS的細胞質(圖1)。

2.2 HSDL2在胃癌組織中的表達UALCAN數據庫分析結果顯示，胃癌組織中HSDL2 mRNA表達水平高于正常胃組織(P<0.05，圖2)。為了進一步明確HSDL2蛋白在胃癌組織中的表達，分別對90例胃癌組織及20例正常胃組織進行免疫組化染色。結果顯示：HSDL2蛋白在正常胃組織中低表達或不表達；在胃癌組織中過表達，且主要表達于細胞質(圖3)。HSDL2蛋白在胃癌組織中的強陽性率為(58.9%，53/90)，高于正常胃組織(5.0%，1/20)，差異有統計學意義(P<0.01，表1)。

表1 胃癌及正常胃組織HSDL2蛋白的表達

**P<0.01：胃癌組織陽性率vs正常胃組織的陽性率；##P<0.01：胃癌組織強陽性率vs正常胃組織的強陽性率

圖1免疫熒光檢測HSDL2蛋白在胃癌細胞SGC-7901和AGS中的定位

圖2 UALCAN數據庫分析HSDL2 mRNA表達水平

圖3免疫組化檢測HSDL2蛋白在胃癌組織中的表達，SP兩步法：A.正常胃組織中HSDL2蛋白呈陰性；B.胃癌組織中HSDL2蛋白呈弱陽性；C.胃癌組織中HSDL2蛋白呈陽性；D.胃癌組織中HSDL2蛋白呈強陽性，染色定位于細胞質并有核周聚集現象

2.3 HSDL2蛋白過表達與胃癌臨床病理特征的關系為探討HSDL2過表達在胃癌惡性演進過程中的作用，本實驗分析HSDL2蛋白過表達與胃癌患者臨床病理特征的關系。結果發現：HSDL2過表達與胃癌分化程度、臨床分期及腫瘤直徑密切相關，與患者性別、年齡及有無淋巴結轉移無明顯相關性。其中，HSDL2在低分化組織中的強陽性率(91.7%)明顯高于高分化組織(0)和中分化組織(46.0%，P<0.01)，HE染色結果與之一致(圖4)；HSDL2在晚期(Ⅲ+Ⅳ期)胃癌組織中的強陽性率(72.9%)高于早期(Ⅰ+Ⅱ期)胃癌組織(20.0%，P<0.01)；HSDL2在胃癌腫瘤直徑>5.0 cm組織中的強陽性率(68.6%)高于腫瘤直徑≤5.0 cm組織(54.5%，P<0.05，表2)。上述結果提示HSDL2蛋白可能參與胃癌的發生、發展，對判斷胃癌的進展有重要的臨床價值。

表2 胃癌臨床病理特征與HSDL2蛋白過表達的相關性[n(%)]

*P<0.05，**P<0.01

2.4 HSDL2蛋白過表達與胃癌患者預后的關系本實驗經GEPIA數據庫統計分析發現，HSDL2蛋白過表達的胃癌患者無瘤生存期(圖5A)低于HSDL2蛋白低表達者(P<0.05)，但兩組總生存期差異無統計學意義(圖5B)；提示HSDL2蛋白表達水平可能對胃癌患者的預后評估具有重要意義。

3 討論

HSDL2最早分離、鑒別于人胎腦組織的cDNA文庫，其cDNA全長3 211 bp，定位于9號染色體長臂的32區[10]。HSDL2蛋白由418個氨基酸構成，包含N末端SDR結構域、C末端甾醇載體蛋白2(sterol carrier protein 2, SCP2)結構域和過氧化物酶體靶向信號(ARL)，可催化多種底物(如類固醇和脂肪酸等)氧化還原反應[11]，其中過氧化物酶體是脂質代謝的核心，可通過結合類固醇脫氫酶其他亞族促進膽固醇代謝及甾體激素的合成[12]。Gallegos等[13]發現HSDL2過表達可加快細胞內膽固醇的合成，提高體內總膽固醇的含量；對小鼠進行高膽固醇喂食后，其體內HSDL2蛋白的表達量也明顯升高，提示HSDL2蛋白可能參與膽固醇代謝的信號傳導并控制其合成。Kowalik等[7]報道HSDL2蛋白在人類、大鼠和小鼠的過氧化物酶體和線粒體中發揮重要作用，并可能與脂肪酸代謝相關，參與脂質代謝，而脂質代謝異常是癌癥的主要標志之一，提示HSDL2蛋白可能與一些腫瘤的發生、發展密切相關。研究顯示HSDL2在乳腺癌組織中異常高表達，且沉默HSDL2可以抑制乳腺癌細胞的增殖能力[8]。值得注意的是，Zhang等[14]通過慢病毒轉染構建膽管癌HSDL2過表達的穩轉細胞株，發現HSDL2過表達可以抑制膽管癌細胞的增殖能力并促進細胞凋亡；提示HSDL2蛋白是一把雙刃劍，在不同癌癥中發揮不同作用。目前，HSDL2蛋白在胃癌中的表達尚未見報道。

圖4免疫組化檢測HSDL2蛋白在低、中、高分化胃癌組織中的表達；HE染色觀察低、中、高分化胃癌組織形態學之間的差異

圖5 GEPIA數據庫分析HSDL2表達與患者生存期的關系：A.無瘤生存期；B.總生存期

本實驗運用UALCAN數據庫分析發現，胃癌組織中HSDL2 mRNA表達水平高于正常胃組織，與本組實驗結果相符。本實驗發現HSDL2蛋白表達主要定位于胃癌細胞胞質，且在胃癌組織中過表達，強陽性率(58.9%)高于正常胃組織(5.0%)。進一步分析發現，HSDL2過表達與胃癌分化程度(P=0.01)、臨床分期(P=0.07)及腫瘤直徑(P=0.017)密切相關；提示隨著胃癌的發生、發展，HSDL2蛋白的表達也呈逐漸升高的趨勢，這與Zeng等[15]在甲狀腺乳頭狀癌中HSDL2表達的結果一致。以上研究結果均提示HSDL2蛋白在腫瘤的發生、發展中，可能發揮重要作用。

本實驗通過GEPIA數據庫分析發現HSDL2過表達的胃癌患者無瘤生存期低于HSDL2低表達患者(P<0.05)，但兩組的總生存期差異無統計學意義，與Sun等[9]在卵巢癌中的研究結果相符。其總生存期差異無統計學意義，可能與數據庫樣本數有關。以上結果提示HSDL2蛋白過表達，可能是胃癌患者預后評估的重要分子標志物之一。

綜上所述，HSDL2蛋白可能參與胃癌的惡性演進過程，對判斷胃癌的進展及預后具有重要的臨床價值。目前，HSDL2在胃癌中過表達的機制尚不清楚。因此深入分析腫瘤發生、發展中的作用及具體分子機制，為胃癌的靶向治療提供可靠、有效的理論與實驗依據。