胃癌中ANP表達與BMP信號通路相互作用對細胞侵襲、轉移的影響

郝美玲，程 玉，劉海旺，李春輝

胃癌發病率及病死率較高，2015年中國癌癥數據報告我國每年胃癌新發患者67.9萬例，死亡患者49.8萬例[1]。研究顯示有些腫瘤細胞中BMP信號通路的抑制劑可通過抑制BMP信號通路，調節基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)表達影響腫瘤細胞的侵襲和轉移[2]。目前，胃癌中心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide, ANP)通過抑制BMP信號轉導通路調節MMP的表達影響胃癌細胞的侵襲和轉移，但具體機制尚未見報道。本文著重探討ANP在胃癌組織和胃癌細胞中的表達，分析ANP表達與BMP信號通路相互作用對細胞侵襲、轉移的影響，為胃癌的發病機制及靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集承德醫學院附屬醫院病理科2018年1月～2018年9月存檔的胃癌標本60例和距腫瘤邊緣≥5 cm正常胃黏膜組織60例。納入標準：患者術前均未行放、化療和免疫治療，具有手術治療適應癥，符合胃腺癌手術病理學診斷標準。按美國癌癥分期聯合委員會(American Joint Committee on Cancer Staging, AJCC)第7版進行分期，男性49例，女性11例；年齡35～81歲，中位年齡58歲；根據WHO(2010)消化系統腫瘤進行組織學分型，其中高分化1例，中分化30例，低分化29例。胃癌細胞株MGC-803由承德醫學院基礎醫學研究所饋贈。

1.2 免疫組化將收集的組織常規取材，石蠟包埋，切片。采用免疫組化EnVision法染色，具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。ANP定位于細胞質中，呈棕黃色顆粒為陽性。應用半定量積分法進行染色細胞的判讀，隨機選取10個高倍視野。(1)根據陽性細胞百分數計分：陽性細胞數≤25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分；(2)根據陽性細胞染色強度計分：未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分[3-4]。將兩項得分結果相乘：0～3分為陰性，4～6分為陽性。

1.3 細胞培養胃癌細胞株MGC-803置于含10%胎牛血清的 RPMI 1640培養液中，于37 ℃ 5% CO2培養箱中培養。培養后的胃癌細胞MGC-803分為兩組：加入ANP組(ANP陽性組)、未加入ANP組(ANP陰性組)。

1.4 Western blot法提取組織及處理后對MGC-803細胞中的蛋白進行標記，存于-80 ℃冰箱中，備用。取等量蛋白置于加樣孔中進行電泳、轉膜、封閉、加入一抗(1 ∶200)、洗膜、加入二抗及洗膜后，于暗室進行顯影，實驗結果以膠片上條帶的方式呈現。

1.5 CCK8法將ANP陽性組與ANP陰性組中的MGC-803細胞制備成單細胞懸液，分別接種于96孔板中(每孔2 000個)，每個時間點設置5個復孔，設立空白對照組即不含細胞的培養基，分別于4、24、48、72 h在上述培養孔中加入終濃度為10%的CCK8試劑，于37 ℃培養箱中繼續孵育2 h，最后利用酶標儀測定450 nm的吸光度值，并繪制腫瘤細胞的生長曲線。細胞存活率(%)=(ANP陽性組OD值-空白組OD值)/(ANP陰性組OD值-空白組OD值)×100%，所得數據進行分析。

1.6 Transwell實驗將基膜基質原液置于4 ℃冰箱過夜融化，將基膜基質原液和預冷的無血清 RPMI 1640 培養液按1 ∶3的比例配制侵襲小室的上室凝膠液，每孔 50 μL 包被侵襲小室的上室，放置 37 ℃ 孵育箱孵育2 h使其成膠。將MGC-803細胞消化制備細胞懸液，Transwell小室上室每孔接種200 μL 不含血清細胞懸液，下室加入含 10%胎牛血清RPMI 1640 培養液500 μL。將Transwell 板置于培養箱中繼續培養24 h后用結晶紫染色。通過顯微鏡觀察被染色的細胞，并進行計數。

2 結果

2.1 ANP的表達與胃癌臨床病理特征的關系免疫組化法檢測60例胃癌組織及對應的正常胃組織中ANP蛋白的表達，結果顯示，ANP蛋白在胃癌組織中的陽性率(18.3%，11/60)低于正常胃組織(78.3%, 47/60)，差異有統計學意義(χ2=19.26,P<0.05，圖1)。本實驗結果顯示，ANP蛋白與患者年齡、性別、TNM分期、組織學分型、浸潤深度及淋巴結轉移均無明顯相關性(P均>0.05，表1)。

2.2 ANP對MGC-803細胞增殖和侵襲的影響采用CCK8法檢測ANP陽性組和ANP陰性組中胃癌細胞MGC-803增殖速度的變化，結果顯示：與ANP陰性組相比，ANP陽性組胃癌細胞的增殖速率下降(P<0.05，表2)。采用Transwell實驗檢測ANP陽性組和ANP陰性組中胃癌細胞MGC-803侵襲能力，結果顯示：ANP作用于胃癌細胞MGC-803 24 h后，ANP陽性組細胞在4、24 h穿過的小孔細胞數分別為(34.72±7.92)個、(114.67±19.27)個，ANP陰性組分別為(54.72±7.84)個、(221.91±17.59)個，兩組之間差異有統計學意義(P<0.05，圖2)。

圖1A. 正常胃黏膜組織中ANP呈強陽性，定位于細胞質，EnVision法；B. 胃腺癌組織中ANP呈陽性，定位于細胞質，EnVision法圖2Transwell實驗檢測ANP陽性組和ANP陰性組中胃癌細胞MGC-803的侵襲能力：A. 4 h后ANP陽性組中胃癌細胞穿孔細胞數；B. 24 h后ANP陽性組中胃癌細胞穿孔細胞數；C. 4 h后ANP陰性組中胃癌細胞穿孔細胞數；D. 24 h后ANP陰性組中胃癌細胞穿孔細胞數

表1 胃癌臨床病理特征與ANP表達的關系

表2 ANP陰性組和ANP陽性組中胃癌細胞MGC-803在不同時間生長速率的變化(%)

與ANP陰性組相比，*P<0.05

2.3 ANP對不同蛋白表達的影響采用Western blot法檢測ANP陽性組和ANP陰性組胃癌細胞中BMP通路相關蛋白BMP6/7、Smad1/5、p-Smad1/5的相對表達量，結果顯示ANP陽性組中BMP6/7、p-Smad1/5的相對表達量[(0.94±0.09)、(1.22±0.10)]比ANP陰性組[(0.24±0.02)、(0.55±0.07)]高，差異有統計學意義(P均<0.05)；Smad1/5的ANP陽性組相對表達量(0.30±0.04)比ANP陰性組(0.52±0.04)減少，差異有統計學意義(P<0.05)；提示ANP可以激活BMP信號通路的信號傳導能力。

Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白在ANP陽性組的相對表達量[(0.85±0.10)、(0.25±0.03)、(0.37±0.04)]比ANP陰性組[(1.13±0.10)、(0.44±0.03)、(0.66±0.07)]均減少，差異有統計學意義(P均<0.05)；提示ANP陽性組胃癌細胞的增殖能力比陰性組下降，且MMP-2、MMP-9蛋白表達減少，降解細胞外基質的能力下降，細胞的侵襲轉移能力也有所下降(圖3)。

圖3 Western blot法檢測ANP陽性組和ANP陰性組中胃癌細胞MGC-803與BMP信號通路活化的作用及對胃癌細胞侵襲轉移的影響：A. ANP陽性組和ANP陰性組中BMP通路相關蛋白BMP6/7、Smad1/5、p-Smad1/5的表達；B. ANP陽性組和ANP陰性組中Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白的表達；C. ANP陽性組和ANP陰性組中BMP6/7、Smad1/5、p-Smad1/5、Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白的相對表達量，*P<0.05

3 討論

胃癌的發病率及病死率在惡性腫瘤中一直居高不下，呈逐年上升趨勢。早期胃癌多無癥狀，發現時多為中晚期，患者預后差，生存質量下降，然而關于胃癌的發病機制尚不清楚[1]，因此探討胃癌的發病機制成為研究熱點。

ANP具有擴血管、利尿、拮抗神經內分泌激素等多種作用，在心血管中報道較多[5]。目前ANP在腫瘤中的研究較少，日本學者發現ANP可抑制肺癌細胞的侵襲轉移[6]，且ANP抑制胃癌細胞的侵襲轉移及在胃癌組織中的表達罕見報道。Li等[7]通過電鏡觀察ANP合成細胞存在于大鼠的胃黏膜組織中，在人正常胃黏膜中也有ANP的表達，定位于胃黏膜細胞的胞質中，本組免疫組化結果顯示ANP在胃癌細胞中的表達量低于正常胃黏膜，提示ANP表達異常與胃癌的發生有重要聯系。本實驗胃癌細胞MGC-803的ANP陽性組與陰性組經Transwell實驗檢測，發現相同時間內ANP陽性組胃癌細胞的侵襲率低于ANP陰性組，且隨時間的推移越來越低；同時利用CCK8法檢測兩組胃癌細胞增殖率發現，ANP陽性組的胃癌細胞增殖率低于陰性組，隨時間的變化越來越低，表明ANP可以降低胃癌細胞MGC-803的增殖和抑制癌細胞的侵襲。

為了明確ANP降低胃癌細胞MGC-803的增殖和抑制癌細胞侵襲的機制，本組實驗檢測ANP陽性組和ANP陰性組中BMP通路中相關蛋白的表達，結果顯示ANP陽性組比ANP陰性組BMP-6/7和p-Smad1/5的表達升高，Smad1/5、Ki-67、MMP-2和MMP-9的表達下降。眾所周知，Ki-67增殖指數下降，細胞的增殖活性降低。MMP-2和MMP-9能降解細胞外基質、影響細胞間質轉化，減少細胞間黏附性，間接促進腫瘤細胞的侵襲轉移。本組實驗結果提示加入ANP后可能刺激BMP信號通路活化，激活Smad1/5磷酸化，影響核內Ki-67、MMP-2和MMP-9的轉錄及其蛋白的翻譯，提高Ki-67、MMP-2和MMP-9蛋白的表達，使腫瘤細胞的增殖活性升高及細胞間的黏附作用減小；提示ANP可通過激活BMP信號通路，促進胃癌細胞的增殖和侵襲轉移等生物學行為。

另外，本組實驗收集胃癌患者的臨床病理特征，并分析胃癌組織中ANP的表達及與臨床病理特征的相關性。結果顯示：ANP在胃癌組織中的表達與患者性別、年齡、組織學分型、浸潤程度、淋巴結轉移、TNM分期均無關，該結果與ANP細胞水平的實驗結果有一定差異，可能與本組樣本數量較少有關，故需加大樣本量進一步分析。

總之，胃癌中ANP可能活化BMP信號轉導通路，并可通過上調Smad1/5的磷酸化，使細胞核中某些基因轉錄異常，影響調控胃癌細胞增殖和降解細胞外基質的能力，發生細胞-間質轉化，影響胃癌的增殖、侵襲和轉移。