紫海膽急性毒性試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)化探討

賴素群, 余露軍, 吳美慧, 曾 進(jìn), 李建軍

(廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所, 廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州510663)

由于工業(yè)三廢、城鎮(zhèn)生活垃圾、農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖使用的化肥、農(nóng)藥和禽畜糞便、海洋油氣開(kāi)采、運(yùn)輸船舶排放、海上事故、近海養(yǎng)殖等污染，我國(guó)渤海、東海和黃海等海域的生態(tài)系統(tǒng)大部分處于亞健康、甚至不健康的狀態(tài)，而且還有進(jìn)一步惡化的趨勢(shì)[1]。環(huán)境污染常是多來(lái)源、多種類(lèi)的復(fù)合污染，存在拮抗、疊加或協(xié)同作用，生物測(cè)試可綜合多種有毒物質(zhì)的相互作用，判定有毒物質(zhì)的質(zhì)量濃度和生物效應(yīng)之間的直接關(guān)系，為水質(zhì)的監(jiān)測(cè)和綜合評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)[2]。篩選合適的海洋污染評(píng)價(jià)生物、建立標(biāo)準(zhǔn)化毒性試驗(yàn)方法是目前我國(guó)亟待解決的一個(gè)問(wèn)題。

海膽具有個(gè)體相對(duì)小、生命力強(qiáng)、適應(yīng)性廣，在實(shí)驗(yàn)室控制條件下容易飼養(yǎng)、繁殖周期相對(duì)短、能分批產(chǎn)卵或連續(xù)產(chǎn)卵和產(chǎn)卵量大等特點(diǎn)，日本、加拿大、新西蘭和美國(guó)等國(guó)家已廣泛采用海膽監(jiān)測(cè)海洋環(huán)境的污染狀況[3,4]，我國(guó)海膽毒性試驗(yàn)也開(kāi)展較多[5-7]，海膽已成為海洋生態(tài)毒理學(xué)研究的模式生物。

紫海膽(Anthocidaris crassispina)屬棘皮動(dòng)物門(mén)，海膽綱，正形目，長(zhǎng)海膽科，紫海膽屬。普遍分布在我國(guó)浙江、福建和廣東各地海岸及日本南部沿海，棲息在淺海的巖礁砂石海底[8]，營(yíng)養(yǎng)豐富，藥用價(jià)值高，是我國(guó)東南沿海重要的經(jīng)濟(jì)品種[9]。

海膽毒性試驗(yàn)受試對(duì)象包括胚胎[5]、浮游幼蟲(chóng)[6]、幼(稚)海膽[7,10]、成海膽[11]等，其中胚胎期和幼蟲(chóng)期是海膽生命中對(duì)污染物最敏感的時(shí)期，美國(guó)材料與試驗(yàn)協(xié)會(huì)(ASTM)于1995年制定《用海膽綱胚胎做靜態(tài)劇毒試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)指南》，并于1998年、2003年、2012年修訂。胚胎毒性試驗(yàn)觀察指標(biāo)包括致死率、致畸率、生長(zhǎng)發(fā)育速度等，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員的技術(shù)要求較高。而海膽浮游幼蟲(chóng)急性毒性試驗(yàn)方法比較簡(jiǎn)單，可能具有較好的應(yīng)用前景。

試驗(yàn)方法的標(biāo)準(zhǔn)化是決定毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)結(jié)果是否可靠的關(guān)鍵所在。影響毒性作用的因素包括毒物因素、機(jī)體因素與環(huán)境因素三個(gè)方面。參比毒物試驗(yàn)可以評(píng)估受試生物對(duì)毒物的敏感性、試驗(yàn)條件、試驗(yàn)的適合度, 為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)室間數(shù)據(jù)比較提供了一個(gè)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)[12]，也可評(píng)估毒性試驗(yàn)的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性[13]。本研究采用的重鉻酸鉀[14]、硫酸鋅[15]、3,5-二氯苯酚[16]、十二烷基硫酸鈉(SDS)[17]為國(guó)際上廣泛認(rèn)可和推薦的參比毒物，以降低毒性試驗(yàn)條件優(yōu)化過(guò)程中毒物因素的影響。本文在其它機(jī)體、環(huán)境因素近似的條件下(如實(shí)驗(yàn)幼蟲(chóng)來(lái)自同一對(duì)親膽，水質(zhì)因子、餌料和投喂量等基本一致)，研究水溫和適宜毒性試驗(yàn)的起始日齡等影響紫海膽急性毒性試驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵因子，以期為紫海膽毒性試驗(yàn)方法的標(biāo)準(zhǔn)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 紫海膽

紫海膽親本來(lái)源于惠州大亞灣，實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)2個(gè)月以上。用注射器將1～3 mL 0.5 mol/L的氯化鉀溶液由圍口膜注入親膽，將親膽反口面向下放置于盛滿過(guò)濾海水的燒杯上，使海水淹蓋生殖孔，收集排放的精卵人工授精，洗卵3～5次，移入幼蟲(chóng)養(yǎng)殖缸培育。

1.2 試劑與儀器

重鉻酸鉀(K2Cr2O7，含量≥99.8%，分析純，廣州化學(xué)試劑廠)、七水硫酸鋅(ZnSO4·7H2O，含量≥99.5%，分析純，廣州化學(xué)試劑廠)、3,5-二氯苯酚(98.15%，分析純，上海麥克林生化科技有限公司)、十二烷基硫酸鈉(SDS，含量≥99.0%，美國(guó)Sigma進(jìn)口分裝)。

電子天平(ME204E)購(gòu)自梅特勒-托利多公司，顯微鏡(萊卡DM1000)購(gòu)自德國(guó)萊卡公司，電導(dǎo)率儀(梅特勒SG3)、pH計(jì)(梅特勒-托利多SG2)購(gòu)自梅特勒-托利多公司，溶氧儀(YSI 550A-2) 購(gòu)自美國(guó)YSI公司，人工氣候箱(HSW-436)購(gòu)自嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 胚胎發(fā)育 6組人工氣候箱，箱內(nèi)溫度分別設(shè)置為20℃、22℃、24℃、26℃、28℃和30 ℃, 各水溫下，天然海膽受精卵，在鹽度29～30、pH 8.1、光強(qiáng)30～100 lx的海水中培育，幼蟲(chóng)孵出24 h后開(kāi)始投喂本實(shí)驗(yàn)室自繁的角毛藻，餌料密度為8 000～10 000 個(gè)/mL。每3 h由各氣候箱隨機(jī)取40個(gè)胚胎或幼蟲(chóng)在顯微鏡下觀察，記錄。

1.3.2 毒性試驗(yàn) 參照GB/T 18420.2-2009[18]中鹵蟲(chóng)試驗(yàn)方法，用等比稀釋法配制試驗(yàn)溶液，設(shè)定5個(gè)等比濃度組和1個(gè)空白對(duì)照組，等比系數(shù)不大于2.0，每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)定4個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)容器采用100 mL燒杯，試驗(yàn)液體積為40 mL，每個(gè)容器放入10個(gè)海膽幼蟲(chóng)。持續(xù)時(shí)間為96 h。試驗(yàn)環(huán)境因子：水溫24～26 ℃，鹽度28～30。每日投喂一次濃縮角毛藻，保持溶液中角毛藻密度約10 000～12 000個(gè)/mL。以死亡為觀測(cè)指標(biāo)，顯微鏡下觀測(cè)沉于容器底部的海膽，15 s內(nèi)腕足停止運(yùn)動(dòng)判定為死亡。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用概率單位法計(jì)算致死中濃度(LC50); 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用表示，采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)、F檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

變異系數(shù)的計(jì)算公式為：變異系數(shù) C·V =(標(biāo)準(zhǔn)偏差SD/平均值Mean)×100%

2 結(jié)果

2.1 海膽胚胎發(fā)育觀察

不同水溫條件下紫海膽發(fā)育至相應(yīng)階段所需時(shí)間見(jiàn)表1，當(dāng)水溫為28 ℃或30 ℃時(shí)，168 h出現(xiàn)大量幼蟲(chóng)沉底死亡，其中30 ℃幼蟲(chóng)全部死亡; 當(dāng)水溫為20 ℃時(shí)，幼蟲(chóng)無(wú)法正常變態(tài)附著，直至觀察到397 h, 所有幼蟲(chóng)死亡。試驗(yàn)結(jié)果表明,24～26 ℃時(shí)孵化成活率較高且孵化速度較快，在此條件下，受精卵孵化至二腕幼蟲(chóng)、四腕幼蟲(chóng)、六腕幼蟲(chóng)、八腕幼蟲(chóng)、出現(xiàn)管足所需時(shí)間分別為29 h、48 h、122 h、182 h和269 h。

2.2 毒性試驗(yàn)

表2～5分別為SDS、Cr6+、Zn2+、3,5-二氯苯酚對(duì)不同日齡海膽幼蟲(chóng)的毒性試驗(yàn)結(jié)果。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，每種參比毒物對(duì)4日齡、6日齡、8日齡、10日齡、12 日齡海膽幼蟲(chóng)的96 h LC50均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。各參比毒物對(duì)不同日齡海膽幼蟲(chóng)LC50的變異系數(shù)為3.7%～100.9%，其中12 日齡海膽幼蟲(chóng)LC50的變異系數(shù)較低。

表 1 不同水溫下紫海膽發(fā)育至相應(yīng)階段所需時(shí)間 h

2.3 參比毒物毒性大小比較

基于海膽浮游幼蟲(chóng)急性毒性試驗(yàn)，參比毒物對(duì)海膽幼蟲(chóng)的毒性順序?yàn)? Cr6+＞Zn2+＞3,5-二氯苯酚＞SDS。

表 2 SDS對(duì)紫海膽幼蟲(chóng)的96 h急性毒性

表 3 Cr6+對(duì)紫海膽幼蟲(chóng)的96 h急性毒性

表 4 Zn2+對(duì)紫海膽幼蟲(chóng)的96 h急性毒性

表 5 3,5-二氯苯酚對(duì)紫海膽幼蟲(chóng)的96 h急性毒性

3 討論

水溫是海膽生長(zhǎng)發(fā)育最主要的影響因子之一[19]，陳錘[20]研究表明，紫海膽適宜生長(zhǎng)水溫為15～30 ℃, 馮雪等[21]通過(guò)對(duì)紫海膽呼吸代謝的研究, 認(rèn)為紫海膽生長(zhǎng)最適溫度為22～27 ℃，其正常生理耐受溫度亦在22～27 ℃，當(dāng)水溫超過(guò)正常耐受溫度時(shí)，正常生理活動(dòng)受到破壞。不同水溫下(15～31℃)紫海膽的活力與攝食實(shí)驗(yàn)[9]表明，紫海膽最適攝食水溫為23～27℃。本研究表明，當(dāng)水溫為28 ℃和30 ℃時(shí)，浮游幼蟲(chóng)出現(xiàn)大量沉底死亡，水溫低于20℃，幼蟲(chóng)無(wú)法變態(tài)附著，24～26 ℃時(shí)孵化成活率較高且孵化速度較快，是紫海膽生長(zhǎng)發(fā)育的最適水溫，與上述研究結(jié)果一致。

變異系數(shù)(CV)，又稱(chēng)“離散系數(shù)”，是概率分布離散程度的一個(gè)歸一化量度，其定義為標(biāo)準(zhǔn)差與平均值之比，常用于比較多個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定的誤差(不精密度水平)[22]。如重鉻酸鉀對(duì)稀有鮈鯽18次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的96 h的LC50值在105.24～288.43 mg/L, CV＜35%; 3,4-二氯苯胺對(duì)稀有鮈鯽18次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的96 h LC50值在4.42～8.75 mg/L，CV＜20%[14]。一般來(lái)說(shuō)，CV越小，可重復(fù)性越強(qiáng)。本研究中，不同日齡海膽幼蟲(chóng)的96 h急性毒性試驗(yàn)結(jié)果CV差別較大，為確保毒性試驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性和可靠性，一般應(yīng)選擇CV較小的實(shí)驗(yàn)條件。根據(jù)本研究，海膽急性毒性試驗(yàn)適宜的起始日齡為12 d。

本研究結(jié)果表明，紫海膽對(duì)水環(huán)境污染物敏感，如SDS對(duì)受精后12日齡紫海膽的96 h LC50為3.95 mg/L，而對(duì)4～6日齡黑褐新糠蝦[23]和鹵蟲(chóng)[24]的96 h LC50分別為11.6 mg/L和13.9 mg/L;Cr6+對(duì)12日齡紫海膽的96 h LC50為1.40mg/L, 而對(duì)體長(zhǎng)為(3.0±1.0) cm稀有鮈鯽[14]和體長(zhǎng)為(2.7±0.4) cm斑馬魚(yú)[25]96 h LC50分別為32.22 mg/L和23.60 mg/L; Zn2+對(duì)12日齡紫海膽的96 h LC50為1.69 mg/L，而對(duì)體質(zhì)量為(0.48±0.13) g中華絨螯蟹仔蟹和體質(zhì)量為(0.014 4±0.003 1) g克氏原螯蝦幼蝦的96 h LC50分別為5.84 mg/L和2.60 mg/L[26], 3,5-二氯苯酚對(duì)12日齡紫海膽96 h LC50為3.60 mg/L，而對(duì)沙蠶(Platynereis dumerilii)幼蟲(chóng)48 h LC50值為3.64 mg/L，此外，且紫海膽個(gè)體小、易于實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)、繁殖周期短、分批產(chǎn)卵、生殖力強(qiáng)，是我國(guó)東南沿海生態(tài)系統(tǒng)中的重要物種，因此，紫海膽是一種較理想的海洋污染物毒性測(cè)試生物。