荷澤顆粒對脾虛大鼠血清胃泌素、D-木糖濃度、磷酸肌酸激酶的影響*

張 明 吳 晶 彭 真 崔榮華 張菁華 向希雄△

（1.湖北省中醫院，湖北 武漢 430061；2.湖北中醫藥大學，湖北 武漢 430061）

脾虛證是脾系系統常見的證候類型，脾乃先天之本，影響一身正氣的盛衰，影響疾病的轉歸，對小兒的生長發育及免疫力尤為重要。荷澤顆粒是湖北省中醫院兒科用于治療小兒單純性肥胖的經驗方，在臨床實踐中，發現此方兼具有健脾作用，故本實驗采用苦寒瀉下、勞倦過度及饑飽失常等復合因素制作脾虛模型，檢測荷澤顆粒對脾虛證大鼠的胃泌素（GAS）、D-木糖濃度及CK活性的影響，以期證實此療效。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性健康Wistar大鼠120只，體質量（180±20）g，購自湖北省實驗動物研究中心。動物生產許可證號：SCXK（鄂）2015-0018。使用許可證號：SYXK（鄂）2017-0095。

1.2 試藥和儀器 生大黃飲片（湖北天濟飲片有限公司）12 kg，入水浸泡30 min，取800 mL浸液煎煮，待水沸騰后，煎煮5 min，過濾、濃縮至濃度為200%的藥液。四君子湯：黨參、云茯苓、白術、炙甘草，按照質量比3∶3∶3∶2組成（即黨參300 g，云茯苓300 g，白術300 g，炙甘草200 g）［1］，浸泡后，常規煎煮2次，用紗布過濾濾液，2次藥液混合后，濃縮至濃度為100%的藥液。荷澤顆粒：荷葉600 g，澤瀉540 g，薏苡仁540 g，蒼術540 g，決明子360 g，枳實180 g，山楂360 g，知母180 g。浸泡后，常規煎煮2次，用紗布過濾濾液，2次藥液混合后，濃縮至濃度為100%的藥液。鼠GAS酶聯免疫吸附測定試劑盒（武漢伊萊瑞特生物有限公司，E-ELR0472c）；D-木糖測定試劑盒（南京建成生物研究所）。CK活性由湖北省中醫院檢驗科中康園代為檢測，采用生化檢測方法。

1.3 分組與造模 實驗前適應性觀察喂養5 d，然后按隨機數字表法分為正常組20只、模型組100只。脾虛大鼠模型制備：采用苦寒瀉下、勞倦過度及飲食失節等復合因素復制脾虛模型［2］，除正常組外，模型組灌服生大黃煎劑4 mL/d，每日將大鼠放入水深50 cm水溫20℃的水槽中游泳，負重10%，以力竭為度（鼻尖沒入水中10 s）。且單日禁食，雙日足量自由飲食，造模21 d（造模過程中損耗部分大鼠）。實驗第22天起，模型組與正常組中各取5只，經腹主動脈采血，離心后檢測兩組大鼠的血清GAS、D-木糖濃度、CK活性，進行驗模，余大鼠繼續實驗，由于造模過程中模型組大鼠的損耗，將剩余的70只大鼠，隨機分為模型組14只、荷澤低劑量組14只、荷澤中劑量組14只、荷澤高劑量組14只、陽性組14只。

1.4 給藥方法 正常組及模型予蒸餾水灌胃3 mL/d，荷澤低、中、高劑量組分別予荷澤顆粒灌胃1.25 mL/d、2.5 mL/d、5 mL/d，陽性組予四君子湯灌胃4 mL/d，共14 d。

1.5 指標檢測 分別于干預后的第7、14日各組各取7只大鼠處死。所有大鼠采血前1 h予3%D-木糖溶液灌胃，劑量2 mL/100 g［3］，1 h后，予10%水合氯醛麻醉。采用ELISA檢測方法檢測GAS、D-木糖濃度；采用生化檢測方法檢測CK活性。

1.6 統計學處理 應用SPSS20.0統計軟件。計量資料以（）表示，組間比較采用方差分析（LSD多重比較）和非參數檢驗（Kruskal-wallis）。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組脾虛證造模情況比較 見表1，圖1。造模期間，與正常組比較，模型組大鼠體質量處于不增與下降的趨勢。造模7 d，除正常組外，各組均出現瞇眼、懶動、扎堆，體質量減輕或不增，大便時干時稀，其間可見脫落的腸黏膜，背毛散亂無光澤，易散落，游泳耐力逐漸下降，此現象一直維持到造模結束。21 d后，與正常組比較，造模各組胃泌素、D-木糖濃度、CK活性均下降（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 兩組各數值比較（±s）

表1 兩組各數值比較（±s）

與模型組同期比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同

組 別n GAS（pg/mL）D-木糖濃度（mmol/L）CK（IU/L）正常組模型組5 5 61.98±12.45 22.56±1.28△△1.52±0.16 0.55±0.06△3 722.4±79.26 1 403±116.74△△

圖1 兩組造模期間體質量變化圖

2.2 各組干預前后大鼠體質量比較 見表2。各組予相應的藥物干預7 d后，各組體質量明顯上漲，以荷澤中、高劑量組及陽性組增長更明顯，與模型組比較，各組均存在統計學差異（P＜0.05）；14 d后，各用藥組體質量增長速度較前回落，與模型組比較，荷澤中、高劑量組及陽性各組差異具有顯著性（P＜0.05）。

表2 各組大鼠體質量比較（g，±s）

表2 各組大鼠體質量比較（g，±s）

組 別n 干預前 干預后7 d 干預后14 d模型組荷澤低劑量組荷澤中劑量組荷澤高劑量組陽性組7 7 7 7 7 216.9±3.0 228.6±3.4 229.3±6.5 226.9±3.3 218.5±4.5 251.8±3.0 284.3±4.7△302.6±9.0△297.9±5.2△295.2±6.7△288.5±3.0 312.9±6.3 340.0±7.6△328.6±6.6△350.3±10.7△

2.3 各組大鼠血清GAS、D-木糖濃度比較 見表3。用藥7 d后，與模型組比較，陽性組、荷澤中劑量組血清GAS不同程度升高（P＜0.05或P＜0.01）；與正常組比較，各用藥組GAS較低，但差異無統計學意義（均P＞0.05）。與模型組比較，陽性組、荷澤中、高劑量組血清D-木糖濃度不同程度升高（P＜0.05或P＜0.01）；與正常組比較，各組D-木糖濃度均較低（P＜0.05或P＜0.01）。用藥14 d后，與正常組比較，荷澤中劑量組、陽性組血清GAS、D-木糖濃度升高（均P＜0.05），此時與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠血清GAS、D-木糖濃度比較（±s）

表3 各組大鼠血清GAS、D-木糖濃度比較（±s）

組別正常組模型組荷澤低劑量組荷澤中劑量組荷澤高劑量組陽性組n 7 7 7 7 7 7 GAS（pg/mL）7 d 63.99±4.07**24.37±1.49△△35.58±2.97 50.37±5.48*38.58±6.53 52.90±4.72*14 d 67.61±9.26 46.79±2.90 68.86±5.76 102.97±11.59**△78.74±11.08*100.43±12.50**△D-木糖濃度（mmol/L）7 d 1.90±0.31*0.56±0.07△△0.67±0.93 1.02±0.07*△△0.79±0.28*1.40±0.13*△△14 d 2.17±0.13 1.92±0.14 2.18±0.19 2.63±0.12**△2.48±0.72*2.81±0.10**△

2.4 各組大鼠CK活性的影響劑量與時間效應比較見表4。用藥7 d后，與模型組比較，荷澤低、中劑量組、陽性組CK不同程度升高（P＜0.05）；與正常組比較，但差異無統計學意義（均P＞0.05）。至14 d后，模型組與正常比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表4 各組大鼠血清CK活性比較（±s）

表4 各組大鼠血清CK活性比較（±s）

組別正常組模型組荷澤低劑量組荷澤中劑量組荷澤高劑量組陽性組n 7 7 7 7 7 7 7 d 2 665.8±381.8△1 595.2±137.8 2 734.8±247.9△2 615.2±323.4△2 115.8±326.4 2 904.0±390.3△14 d 2 780.2±369.0 2 196.6±268.8 2 306.8±356.5 2 587.6±166.1 2 314.4±366.1 2 353.2±88.7

3 討 論

3.1 脾虛證候的造模方法 《脾胃論》云“大忌苦寒之藥傷其脾胃”，本次實驗采取了苦寒瀉下、饑飽失常及勞倦過度復合因素造模法復制脾虛模。大鼠出現體質量降低、活動減少、便溏、毛發不澤等癥，其表現的各種虛弱癥狀與臨床脾虛癥狀相似，在一定程度上反映了脾虛狀態的病理改變，因而該模型有其中醫理論依據和實驗基礎。眾多文獻推薦采用多因素復合造模方法，其一：單一因素造模，存在造模因素撤除后自然恢復快的問題［4］。因此，本次實驗采用復合因素，加大復制脾虛模型的力度，增強模型的穩定性。楊云等用勞倦及饑飽造脾虛模型進行實驗研究，表明此法模型復健期較長，較為穩定［5］。其二：對一個證候而言，是有多種致病因素造成的，勞倦過度、饑飽失常法模擬現代人生活飲食不規律、作息不規律，休息時間少，本次實驗造模方法貼近臨床。臨床上脾虛證的病因往往不是單一的，而是多種因素的共同作用結果，故綜合因素造模法才更接近臨床［6］。根據全國中西醫結合虛證老年病防治學術會議制訂的中醫虛證參考標準及北京師范大學造脾虛證模型標準，制定脾虛動物模型大致的標準是：1）泄瀉嚴重時甚至嚴重脫肛；2）食少納呆；3）消瘦，體質量減輕；4）神態萎靡、四肢不收，毛色枯槁；5）蜷縮聚堆；6）易疲勞。第1、2項為主癥，第3～6項為兼癥，具備兩項主癥和兩項兼癥時，即可以認為脾虛證造膜成功［7］。本次實驗購120只Wistar大鼠，造模大鼠100只，實驗過程中損耗15只，其余造模大鼠均達到上述的脾虛模型標準，其模型成功率達85%；且造模21 d后，與正常組比較，造模各組GAS、D-木糖濃度、CK活性均下降，且存在統計學差異，本次研究的模型不僅在癥狀上符合脾虛的標準，從客觀的指標上，也提示造模組大鼠處于脾虛的狀態。

GAS作用于消化系平滑肌上的GAS受體，興奮與磷脂酶C耦聯的G蛋白，產生三磷酸肌醇，激發胃平滑肌細胞的收縮反應，同時也是胃酸分泌的主要調節激素，與組胺、乙酰膽堿共同刺激壁細胞分泌胃酸。實驗結果表明脾虛胃腸動力障礙模型大鼠GAS明顯降低，用藥后GAS可升高。D-木糖是一種五碳糖，通常在血液中并不存在，口服后可在小腸被吸收，故口服D-木糖后在一定時間內血和尿中D-木糖濃度基本上可以反映小腸吸收功能狀況。GAS使胃蛋白酶原分泌增多，消化道黏膜修復，因此，血清D-木糖吸收增加，其測得的濃度升高。因此，GAS、D-木糖濃度可以間接反映脾氣虛證的嚴重程度及治療后的恢復情況。本次研究結果顯示，造模21 d后，與正常組相比，模型組GAS、D-木糖濃度明顯降低。干預7 d后，與模型組相比，陽性組、荷澤中劑量組血清GAS不同程度升高；與正常組相比，各用藥組GAS值較低，但差異不具有顯著性。與模型組相比，陽性組、荷澤中劑量組D-木糖濃度均較高，差異具有顯著性；與正常組相比，各組D-木糖濃度均較低，差異具有顯著性。干預14 d后，荷澤中、高劑量組、陽性組GAS、D-木糖濃度與同期模型組相比，差異具有顯著性；與正常組相比，荷澤中劑量組、陽性組組GAS較正常組高，差異具有顯著性，而模型組則無顯著差異。GAS屬于胃腸激素，受中樞調節，在急性恢復期，GAS顯著增高，可能與反饋作用相關［10］，它能激發胃平滑肌細胞的收縮反應，增強胃腸蠕動，同時使胃蛋白酶原分泌增多，消化道黏膜修復，與D-木糖濃度具有一定的相關性。CK主要存在于骨骼肌、心肌及腦組織中，在細胞能量代謝中起重要作用，催化肌酸和ATP或磷酸肌酸和ADP之間的可逆反應。CK作用生成的磷酸肌酸含高能磷酸鍵，是肌肉收縮時能量的直接來源［11］。根據CK的主要生理功能及本次實驗研究的結果分析，脾虛模型的CK明顯降低，脾虛模型大鼠機體存在能量代謝障礙。在中醫基礎理論中，“脾主肌肉”的基本理論明確了脾胃功能與肌肉關系密切，脾虛癥狀可表現為肌肉瘦削，松軟無力。本次實驗結果顯示造模完成后血清CK活性顯著降低，干預7 d后，與模型組相比，荷澤低、中劑量組，陽性組CK不同程度增加，且差異具有顯著性；與正常組相比，各用藥組差異不具有顯著性；干預14 d后，模型組和正常組亦無統計學差異。徐琦等從脾氣虛模型大鼠血清中測定CK活性，結果發現脾氣虛大鼠CK低于正常組，自然恢復組及用藥組治療3周后，兩組均恢復正常，與正常組無統計學差異［12］，與本次實驗結果一致。

3.2 荷澤顆粒對脾虛大鼠的治療作用 本方本荷澤顆粒是湖北省中醫院兒科多位專家經過多年的經驗總結，主要針對于兒童單純性肥胖中的脾虛濕盛證型，治療上以健脾利濕為原則。荷澤顆粒前期已進行了本方配合飲食運動療法治療兒童單純性肥胖的臨床研究，臨床有效率達86.7%［13］。此外，荷澤顆粒還可降低瘦素水平，升高脂聯素水平，在肥胖發生發展中起到調節能量代謝的重要作用［14］。全方由荷葉10 g，蒼術9 g，澤瀉9 g，薏苡仁9 g，山楂 6 g，決明子6 g，炒枳實3 g，知母3 g組成。全方以荷葉、蒼術為君藥，薏苡仁、澤瀉為臣藥，生山楂、炒枳實、草決明、知母均為佐助。諸藥合參，共奏健脾利濕、理氣消食潤腸之功。在中醫基本理論中，脾失健運，不能正常運化谷物和水液，水反為濕，濕則困脾，進而影響氣機的運行，導致氣機郁滯，進一步出現精微不布，化為膏脂；反之，脾健，則水濕、膏脂可化［15］。荷澤顆粒既可用于脾虛濕盛型厭食證患兒，也可用于此種證型單純性肥胖患兒，體現了中醫異病同治的原則。本次實驗證明，荷澤顆粒中劑量組與四君子湯療效相當，對脾虛大鼠有可靠的治療作用。其他劑量組也有不同程度的療效，但不如中劑量組，低劑量組考慮與藥物濃度相關；高劑量組考慮灌胃量大，影響大鼠進食。同時，隨著用藥時間的延長，胃泌素、D-木糖濃度明顯增高，但14d后，模型組與正常組間無統計學差異，說明大鼠具有一定的自我調節，其自愈性強，模型組動物的脾虛癥狀均有所恢復，模型持續期不長。