基于一測(cè)多評(píng)法對(duì)丁蔻理中丸中6種成分的質(zhì)量控制研究

楊 麗，何勝利（.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州 450000；.遂成藥業(yè)股份有限公司，河南 鄭州 4550）

丁蔻理中丸處方源于《衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第一冊(cè)，由干姜、炒白術(shù)、豆蔻、黨參、丁香和甘草6味中藥材加工而成，具有溫中散寒、補(bǔ)脾健胃的功效，主要用于脾胃虛寒、脘腹攣痛、嘔吐泄瀉、消化不良等病癥的治療[1]。本文參考中藥質(zhì)量標(biāo)志物以君藥為主，兼顧臣、佐、使藥的確定原則，選取方中君藥干姜所含6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚，臣藥白術(shù)所含白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和佐藥丁香所含丁香酚為目標(biāo)成分，以白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ為內(nèi)標(biāo)物，建立其與白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、丁香酚、6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚的校正因子，計(jì)算各成分含量，探討一測(cè)多評(píng)法在丁蔻理中丸多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)中應(yīng)用的可行性。

1 儀器與試藥

LC-10ATvp型高效液相色譜儀（日本島津儀器公司）；Agilent 1120型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；AB135-S型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；SB-5200DT加熱型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。對(duì)照品白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（批號(hào)：111978-201501，含量99.9%）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ（批號(hào)：111975-201501，含量99.9%）、丁香酚（批號(hào)：110725-201716，含量99.6%）、6-姜辣素（批號(hào)：111833-201806，含量99.9%）、8-姜酚（批號(hào)：111993-201601，含量93.8%）、10-姜酚（批號(hào)：111994-201501，含量97.1%）均來源于中國食品藥品檢定研究院；丁蔻理中丸（規(guī)格：每26粒重1 g，批號(hào)：117005、117007、117008）來源于山西天生制藥有限責(zé)任公司；甲醇、乙腈為色譜純，其它試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Agilent Extend C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30 ℃；流動(dòng)相A：甲醇-乙腈（1∶1），流動(dòng)相B：0.1%磷酸溶液，梯度洗脫：0～11.0 min，55.0%A；11.0～28.0 min，55.0%A→68.0%A；28.0～46.0 min，68.0%A→84.0%A；46.0～55.0 min，84.0%A→55.0%A；體積流量1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)分別為220 nm（0～21.0 min檢測(cè)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ）[2-5]和280 nm（21.0～55.0 min檢測(cè)丁香酚、6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚）[6-8]；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 混合對(duì)照品溶液

精密稱取白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、丁香酚、6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚對(duì)照品適量，用70%甲醇分別制成每1 mL含0.218、0.142、2.734、1.208、0.292、0.356 mg的單成分儲(chǔ)備液。再依次精密吸取單成分儲(chǔ)備液各2.5 mL，用70%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為10.9、7.1、136.7、60.4、14.6和17.8 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.3 丁蔻理中丸供試品溶液

取丁蔻理中丸適量，研細(xì)，混勻，取約1.0 g，精密稱定，精密加入70%甲醇25 mL，稱重，SB-5200DT加熱型超聲波清洗機(jī)超聲（功率：360 W，頻率：40 kHz）提取40 min，放冷，稱重，用70%甲醇補(bǔ)重，搖勻，過濾，制成丁蔻理中丸供試品溶液。

2.4 陰性對(duì)照溶液

按照丁蔻理中丸的處方比例和制法，分別制備不含白術(shù)、不含丁香、不含干姜的3種陰性對(duì)照樣品，再按“2.3”項(xiàng)下方法制成對(duì)應(yīng)的3種陰性樣品溶液。

2.5 專屬性實(shí)驗(yàn)

取上述丁蔻理中丸供試品溶液、陰性對(duì)照溶液及混合對(duì)照品溶液依法進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖，色譜圖見圖1。結(jié)果表明陰性對(duì)照對(duì)測(cè)定無干擾，理論塔板數(shù)按待測(cè)成分色譜峰計(jì)均不低于3500，待測(cè)成分色譜峰與相鄰峰均能達(dá)到有效分離，分離度均大于1.5。

2.6 線性關(guān)系考察

圖1 HPLC色譜圖A-混合對(duì)照品，B-供試品，C-白術(shù)陰性樣品，D-丁香陰性樣品，E-干姜陰性樣品；1-白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ，2-白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，3-丁香酚，4-6-姜辣素，5-8-姜酚，6-10-姜酚Fig 1 HPLC chromatogramsA-mixed reference substance, B-sample, C-negative sample without atractylodis macrocephalae rhizoma, D-negative sample without caryophylli flos, E-negative sample without zingiberis rhizoma; 1-atracylenolideⅢ, 2-atracylenolideⅠ, 3-eugenol, 4-6-gingerol, 5-8-gingerol, 6-10-gingerol

分別精密量取“2.2”項(xiàng)下單成分儲(chǔ)備液各2.0 mL，置同一20 mL量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，制成線性混標(biāo)溶液A；再精密量取線性混標(biāo)溶液A各適量，用70%甲醇依次稀釋2、4、8、16、20倍，制成線性混標(biāo)溶液B～F，依法進(jìn)樣測(cè)定6個(gè)成分色譜峰的峰面積，以質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)，峰面積y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 1 The results of the linear relationship test

2.7 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取同一份丁蔻理中丸供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、丁香酚、6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚峰面積的RSD分別為1.02%、1.13%、0.58%、0.72%、0.98%、0.85%。

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批次的丁蔻理中丸供試品適量，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、丁香酚、6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚的峰面積，計(jì)算待測(cè)成分含量，結(jié)果所測(cè)6種成分含量的RSD分別為1.83%、0.96%、0.55%、1.60%、1.89%、0.76%。

2.9 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一份丁蔻理中丸供試品溶液，于0、2、4、8、12、16 h進(jìn)樣檢測(cè)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、丁香酚、6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚的峰面積，結(jié)果示丁蔻理中丸供試品溶液室溫下16 h內(nèi)穩(wěn)定，6種成分峰面積的RSD分別為0.98%、1.07%、0.63%、1.75%、0.92%、0.81%。

2.10 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取同一批次已知含量的丁蔻理中丸樣品適量，研細(xì)，取9份，每份約0.5 g，精密稱定，參考《中國藥典》（2015年版）四部藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則要求，分別精密加入另行配制的混合對(duì)照品溶液（白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ 0.124 mg·mL-1、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ0.082 mg·mL-1、丁香酚1.758 mg·mL-1、6-姜辣素0.784 mg·mL-1、8-姜酚0.156 mg·mL-1、10-姜酚0.214 mg·mL-1）0.5 mL3份、1.0 mL3份、1.5 mL3份，再按上述方法制成加樣供試品溶液，依次進(jìn)樣測(cè)定各成分峰面積，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果示各成分的平均加樣回收率分別為97.86%、96.95%、100.03%、99.31%、97.74%、98.48%，RSD分別為1.09%、1.26%、0.85%、0.65%、1.54%、1.12%。

2.11 校正因子的計(jì)算

精密吸取“2.6”項(xiàng)下制備的線性混標(biāo)溶液F～A各適量，依法進(jìn)樣測(cè)定各成分的峰面積，以白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ為內(nèi)標(biāo)物，根據(jù)校正因子計(jì)算公式?內(nèi)/待=?內(nèi)/?待=（y內(nèi)x待）/（y待x內(nèi)）（式中y內(nèi)為白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的峰面積，x內(nèi)為白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的質(zhì)量濃度，y待為待測(cè)成分的峰面積，x待為待測(cè)成分的質(zhì)量濃度）計(jì)算白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、丁香酚、6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚的校正因子，結(jié)果見表2。

表2 各成分的校正因子Tab 2 Correction factors of various constituents

2.12 不同儀器、不同色譜柱對(duì)校正因子的影響

對(duì)比考察2臺(tái)高效液相色譜儀及3種色譜柱對(duì)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、丁香酚、6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚校正因子的影響，結(jié)果顯示白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、丁香酚、6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚校正因子的RSD分別為0.62%、1.03%、0.90%、0.68%、1.28%，表明不同儀器、不同色譜柱對(duì)校正因子無顯著影響，結(jié)果見表3。

2.13 待測(cè)成分色譜峰的定位

本文以白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ為內(nèi)標(biāo)色譜峰，考察兩臺(tái)高效液相色譜儀及3種色譜柱條件下，待測(cè)成分白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、丁香酚、6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間值，結(jié)果顯示白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、丁香酚、6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚相對(duì)保留時(shí)間值的RSD分別為0.52%、0.37%、0.71%、0.86%、0.65%，表明不同儀器、不同色譜柱對(duì)相對(duì)保留時(shí)間值無顯著影響，結(jié)果見表4。

2.14 丁蔻理中丸含量測(cè)定中QASM法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果的比較

取3個(gè)批次的丁蔻理中丸供試品，每個(gè)批次平行制備3份供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定各成分的峰面積，分別采用一測(cè)多評(píng)法和外標(biāo)法計(jì)算丁蔻理中丸中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、丁香酚、6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚的含量，結(jié)果見表5。結(jié)果表明一測(cè)多評(píng)法計(jì)算值與外標(biāo)法測(cè)定值無顯著差異。

3 討論

3.1 待測(cè)定成分的選擇

丁蔻理中丸由干姜、炒白術(shù)、豆蔻、黨參、丁香和甘草等6味中藥材加工而成，方中干姜辛熱、溫中散寒，為君藥；白術(shù)、豆蔻健脾燥濕、溫中消食，黨參健脾益肺，合為臣藥；丁香辛溫、降逆止嘔，為佐藥；甘草調(diào)和諸藥兼補(bǔ)脾和中為使藥，全方藥味合用，共達(dá)溫中散寒、補(bǔ)脾健胃的功效。6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚等姜酚類為干姜的代表性成分[9]，白術(shù)主要含有內(nèi)酯類和揮發(fā)油成分，其中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ等內(nèi)酯類成分為其主要有效成分；丁香主要含丁香酚等揮發(fā)油成分，本文選取白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、丁香酚、6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚為定量測(cè)定目標(biāo)成分。

3.2 供試品制備方法的選擇

本研究依次對(duì)供試品制備的提取溶劑（甲醇[2-5,8]、70%甲醇[6]、95%乙醇）、制備方式（超聲提取[2-5,10]、加熱回流提取[11]）和提取時(shí)間（20、40、60 min）進(jìn)行對(duì)比考察，以所測(cè)各成分的綜合提取率為指標(biāo)，結(jié)合色譜峰峰形及分離度等指標(biāo)，同時(shí)考慮到操作的便捷性，最終確定采用70%甲醇超聲提取40 min作為丁蔻理中丸供試品溶液的制備方法。

綜上，本研究采用一測(cè)多評(píng)法實(shí)現(xiàn)了對(duì)丁蔻理中丸所含成分白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、丁香酚、6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚的同時(shí)測(cè)定，所建立的方法操作便捷，結(jié)果準(zhǔn)確，降低了檢驗(yàn)成本，為丁蔻理中丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高研究提供有力的數(shù)據(jù)支持。HPLC指紋圖譜具有整體性、模糊性、專屬性等特點(diǎn)，采用HPLC指紋圖譜對(duì)丁蔻理中丸藥品質(zhì)量的整體描述和評(píng)價(jià)還有待進(jìn)一步研究。

表5 含量測(cè)定結(jié)果.n = 3，mg·g-1Tab 5 Results of content determination of various constituents.n = 3, mg·g-1