達(dá)原飲中芍藥苷和黃芩苷在大鼠體內(nèi)藥動學(xué)研究

利 玲，胡 秀，利 莉（1.鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院，湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 黃石 435000；2.腎臟疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃石 435000）

達(dá)原飲，又名達(dá)原散，由檳榔、厚樸、草果仁、知母、芍藥、黃芩、甘草七味中藥組方而成[1]。現(xiàn)代多應(yīng)用于各種發(fā)熱、盜汗、病毒性腦炎等[2-3]。目前已有多項(xiàng)研究報(bào)道采用高效液相色譜法測定達(dá)原飲中芍藥苷、黃芩苷等有效成分的含量[4-5]，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）技術(shù)建立了同時測定大鼠血漿中芍藥苷和黃芩苷濃度的方法，并成功應(yīng)用于大鼠灌胃達(dá)原飲后的芍藥苷和黃芩苷藥代動力學(xué)研究。該方法滿足臨床前藥代動力學(xué)研究中對于專屬性和線性、準(zhǔn)確度和精密度、基質(zhì)效應(yīng)和回收率、穩(wěn)定性的要求，方法靈敏，簡便易行，適用于達(dá)原飲的藥代動力學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1 儀器

美國Finnigan公司TSQ Quantum Discovery MAX型液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)（LC-MS/MS，美國Finnigan公司）；Eppendorf 5427 R臺式高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf中國有限公司）；XW-80A 旋渦混合器（上海青浦滬西儀器廠）；BS110S型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；KQ 500DE型數(shù)控超聲波清潔器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥物與試劑

芍藥苷（純度：96.4%，批號：110736-201438）購自中國食品藥品檢定研究院；黃芩苷（純度：93.3%，批號：110715-201318）購自中國食品藥品檢定研究院；黃芪甲苷（內(nèi)標(biāo)，純度：93.0%，批號：110781-201515）購自中國食品藥品檢定研究院；芍藥、黃芩、檳榔、厚樸、草果、知母、甘草藥材購自湖北蘄州中藥材市場；色譜純甲醇和乙腈購自美國Fisher Scientific公司；水為娃哈哈飲用純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

1.3 動物

6只雄性SD大鼠，體質(zhì)量（220±20）g，購自北京維通利華動物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動物合格證號：SCXK（京）2014-0016。動物飼養(yǎng)于溫度控制在（25±2）℃、濕度控制在40%-60%的環(huán)境中，每天交替進(jìn)行12 h光照，12 h黑暗處理。

1.4 色譜和質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱為Inersil ODS柱（4.6 mm×50 mm，5 μm）；流動相采用水-乙腈梯度洗脫，梯度洗脫程序如下：0～0.2 min，乙腈保持20%；0.2～1.2 min，乙腈由20%增加到45%；1.2～2.0 min，乙腈由45%增加到80%；2.0～3.0 min，乙腈保持80%；3.0～3.1 min，乙腈由80%變?yōu)?0%；3.1～5.0 min，乙腈保持20%。柱溫設(shè)定為35 ℃；進(jìn)樣倉溫度控制在10 ℃；流速0.5 mL·min-1；進(jìn)樣量10 μL；分析時間5 min。

1.4.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧（ESI）離子源，正離子模式，掃描方式為選擇離子檢測（selective reaction monitoring，SRM），噴霧電壓3500 V，霧化溫度250 ℃，毛細(xì)管溫度300 ℃。監(jiān)測離子對分別為：芍藥苷m/z 502.9→m/z 341.0，黃芩苷m/z 469.2→m/z 293.3，黃芪甲苷（內(nèi)標(biāo)）m/z 806.9→m/z 626.9；碰撞能分別為26 V、16 V、35 V。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品的配制

精密稱取黃芪甲苷對照品適量，用二甲基亞砜溶解，配制成濃度為5 mg·mL-1的黃芪甲苷儲備液，臨用時用甲醇稀釋成黃芪甲苷濃度為1000 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)工作溶液。

精密稱取芍藥苷和黃芩苷對照品適量，分別用甲醇溶解，并配制成濃度均為10 mg·mL-1的儲備液。臨用前將兩個儲備液等體積混合，用甲醇逐級稀釋，配制成濃度為50、250、2000、10 000、15 000、20 000 ng·mL-1的混合系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。將空白大鼠血漿與混合系列標(biāo)準(zhǔn)溶液按照體積比90∶10混合，使得大鼠血漿中的芍藥苷和黃芩苷系列濃度均為5、25、200、1000、1500、2000 ng·mL-1。質(zhì)控樣品（quality control，QC）按照同樣方法配制，大鼠血漿中芍藥苷和黃芩苷的濃度均為10、800、1600 ng·mL-1。

1.6 血漿樣品處理

采用有機(jī)溶劑直接沉淀法處理大鼠血漿樣品。取100 μL大鼠血漿樣品，加入300 μL內(nèi)標(biāo)工作溶液，渦旋振蕩60 s，充分混合后，于14 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心10 min，分離上清液加入樣品瓶，進(jìn)樣10 μL進(jìn)行LC-MS/MS分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品也采用同樣方法進(jìn)行處理。

1.7 大鼠藥動學(xué)實(shí)驗(yàn)

6只雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，實(shí)驗(yàn)前1天至少禁食12 h，不禁水，達(dá)原飲按照10 g·kg-1的劑量[5-7]（相當(dāng)于芍藥苷11 mg·kg-1，黃芩苷64 mg·kg-1）灌胃給予大鼠，分別于給藥前和給藥后5、15、30、60、120、240、360、480、720 min于大鼠眼球靜脈叢取血250 μL置于肝素化的離心管中，以3500 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心15 min，分離上層血漿于-20 ℃保存待測[8-11]。

1.8 數(shù)據(jù)處理

計(jì)數(shù)資料以（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，芍藥苷和黃芩苷的主要藥代動力學(xué)參數(shù)采用DAS 2.0軟件進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1 專屬性 采用大鼠空白血漿樣品、大鼠空白血漿加入被測物標(biāo)準(zhǔn)液和內(nèi)標(biāo)的樣品、大鼠給藥1 h后血漿樣品進(jìn)行處理進(jìn)樣，得到大鼠血漿中被測物和內(nèi)標(biāo)的典型色譜圖，見圖1。顯示血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾被測物和內(nèi)標(biāo)的測定，且被測物和內(nèi)標(biāo)之間的分離度良好。芍藥苷、黃芩苷和內(nèi)標(biāo)的出峰時間分別為1.91 min、3.08 min、3.69 min，出峰位置無干擾，方法的專屬性良好。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限 采用加權(quán)最小二乘法計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，以被測物與內(nèi)標(biāo)黃芪甲苷的峰面積比值為Y，以被測物的質(zhì)量濃度為X，得到芍藥苷的回歸方程為Y = 5.148×10-4X-2.6148×10-3，權(quán)重因子W = 1/X2，相關(guān)系數(shù)r2= 0.995 1；黃芩苷的回歸方程為Y = 6.613×10-4X + 1.863 2×10-3，權(quán)重因子W = 1/X2，相關(guān)系數(shù)r2= 0.996 5。芍藥苷和黃芩苷的定量下限均為5 ng·mL-1，連續(xù)進(jìn)樣6次，被測物準(zhǔn)確度在80%-120%范圍內(nèi)，精密度（RSD）小于20%，參照《藥物非臨床藥代動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，該結(jié)果符合生物樣品測試要求。

圖1 大鼠血漿特征色譜圖A-大鼠空白血漿樣品，B -大鼠空白血漿加入被測物和內(nèi)標(biāo)，C-大鼠給藥1 h后血漿樣品；1-黃芩苷，2-芍藥苷，3-黃芪甲苷（內(nèi)標(biāo)）Fig 1 Chromatograms of rat plasmaA-blank plasma sample of rats, B-blank plasma sample of rats spiked with analytes and IS, C-plasma sample of rats after 1 h administration of dayuanyin; 1-baicalin, 2-peoniflorin, 3-astragalosideⅣ (internal standard, IS)

表1 大鼠血漿中芍藥苷與黃芩苷的精密度與準(zhǔn)確度Tab 1 The precision and accuracy of peoniflorin and baicalin in rat plasma

2.1.3 精密度與準(zhǔn)確度 采用三個濃度水平的QC樣品考察大鼠血漿中芍藥苷與黃芩苷的批內(nèi)與批間精密度和準(zhǔn)確度（n = 6）。芍藥苷批內(nèi)準(zhǔn)確度在96.30%-105.02%范圍內(nèi)，批內(nèi)精密度（RSD）小于12.41%；批間準(zhǔn)確度在97.80%-106.65%范圍內(nèi)，批間精密度（RSD）小于10.63%。黃芩苷批內(nèi)準(zhǔn)確度在93.67%-101.30%范圍內(nèi)，批內(nèi)精密度（RSD）小于10.07%；批間準(zhǔn)確度在99.80%-112.44%范圍內(nèi)，批內(nèi)精密度（RSD）小于11.12%。結(jié)果見表1，顯示方法精密度和準(zhǔn)確度均符合生物樣品測試要求。

2.1.4 回收率與基質(zhì)效應(yīng) 采用三個濃度水平的QC樣品考察大鼠血漿中芍藥苷與黃芩苷的回收率與基質(zhì)效應(yīng)（n = 3）?？瞻状笫笱獫{中加入被測物經(jīng)處理后的藥物響應(yīng)值與大鼠空白血漿處理后加入相同濃度被測物響應(yīng)值的比值作為提取回收率，以具有基質(zhì)的被測物標(biāo)準(zhǔn)品與不含基質(zhì)的被測物標(biāo)準(zhǔn)品溶液的響應(yīng)強(qiáng)度的比值作為基質(zhì)效應(yīng)。芍藥苷提取回收率在（89.75±7.55）%-（98.52±10.23）%范圍內(nèi)，基質(zhì)效應(yīng)在（88.14±8.34）%-（92.97±8.76）%范圍內(nèi)；黃芩苷提取回收率在（88.95±9.88）%-（94.56±7.70）%范圍內(nèi)，基質(zhì)效應(yīng)在（92.98±8.89）%-（96.22±5.90）%范圍內(nèi)。精密度（RSD）均在15%以內(nèi)。結(jié)果見表2，顯示方法回收率和基質(zhì)效應(yīng)均符合生物樣品測試要求。

表2 大鼠血漿中芍藥苷與黃芩苷的提取回收率與基質(zhì)效應(yīng).n = 3Tab 2 The extraction recovery and matrix effect of peoniflorin and baicalin in rat plasma.n = 3

2.1.5 穩(wěn)定性 表3結(jié)果顯示，采用低、高兩個水平濃度的QC樣品考察大鼠血漿中芍藥苷與黃芩苷在實(shí)驗(yàn)臺放置6 h，-20 ℃冷凍保存15 d和處理后在樣品倉放置24 h的穩(wěn)定性（n = 6），結(jié)果顯示芍藥苷和黃芩苷在上述儲存條件下穩(wěn)定性良好。

表3 大鼠血漿中芍藥苷與黃芩苷的穩(wěn)定性.n = 6Tab 3 The stability data of peoniflorin and baicalin in rat plasma.n = 6

2.2 大鼠體內(nèi)藥動學(xué)評價(jià)

大鼠灌胃給予10 g·kg-1達(dá)原飲后，芍藥苷和黃芩苷的吸收速度均較快，達(dá)峰時間均較早，且消除也很迅速；黃芩苷出現(xiàn)雙峰，其具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。將給藥劑量、給藥方式、動物種屬和測得的血漿藥物濃度等信息輸入DAS 2.0軟件處理后得到芍藥苷與黃芩苷的主要藥代動力學(xué)參數(shù)，詳見表4，芍藥苷和黃芩苷的血漿藥物濃度-時間曲線見圖2。

表4 芍藥苷與黃芩苷的主要藥代動力學(xué)參數(shù).n = 6Tab4 Main pharmacokinetic parameters of peoniflorin and baicalin.n = 6

圖2 芍藥苷和黃芩苷在大鼠體內(nèi)的藥-時曲線.n = 6Fig 2 Plasma concentration-time profiles of peoniflorin and baicalin in rats.n = 6

3 討論

3.1 測定方法與線性范圍的確定

采用高效液相色譜法探討達(dá)原飲中芍藥苷、黃芩苷等有效成分含量的研究已有報(bào)道[4-5]，考慮到高效液相色譜法的靈敏度較低，且達(dá)原飲中各有效成分的含量較低，故本研究采用LC-MS/MS技術(shù)研究達(dá)原飲中兩種成分在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征，建立了大鼠血漿中芍藥苷和黃芩苷濃度同時測定的方法，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。兼顧本實(shí)驗(yàn)室液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)的儀器性能、達(dá)原飲中芍藥苷和黃芩苷的含量及給藥劑量，本研究將兩種化合物的線性范圍設(shè)定為5～2000 ng·mL-1可以滿足本藥代動力學(xué)研究的需要。

3.2 前處理方法、流動相及色譜柱的選擇

本研究重點(diǎn)考察直接沉淀法處理大鼠血漿樣品，包括有機(jī)溶劑直接沉淀法，金屬鹽溶液直接沉淀法以及酸堿沉淀法等，結(jié)果顯示采用有機(jī)溶劑直接沉淀法處理血漿樣品，方法操作方便，簡單易行，成本較低，處理效率高，適合較大樣本量的處理，且專屬性和靈敏度能夠滿足本研究的需要。流動相考察水-甲醇和水-乙腈兩種體系的等度洗脫和梯度洗脫方法，最終確定水-乙腈梯度洗脫適合被測物和內(nèi)標(biāo)的分離。另外，色譜柱采用Inersil ODS柱（4.6 mm×50 mm，5 μm），獲得了良好的峰形、分離度和合適的保留時間。

3.3 內(nèi)標(biāo)的選擇

理論上內(nèi)標(biāo)的最佳選擇是同位素內(nèi)標(biāo)，但是本研究被測物芍藥苷和黃芩苷的同位素內(nèi)標(biāo)價(jià)格昂貴，較難獲得，故本研究采用黃芪甲苷作為內(nèi)標(biāo)，其與本研究被測物均為皂苷類化合物，在本實(shí)驗(yàn)室質(zhì)譜系統(tǒng)內(nèi)的正離子模式下，具有相同的加合離子[M+Na]+峰，可以確保質(zhì)譜定量的準(zhǔn)確性。

3.4 研究意義

達(dá)原飲方中芍藥清熱滋陰，可防諸辛燥藥之耗散陰津；黃芩苦寒，清熱燥濕。二者共為佐藥。配合方中其它藥味即可達(dá)奏開達(dá)膜原，辟穢化濁，清熱解毒之功[12-13]。其中，芍藥苷和黃芩苷分別為方中芍藥和黃芩的主要藥效成分，也是達(dá)原飲中含量相對較高的兩種藥效成分[4]。芍藥苷具有抗腫瘤、抗氧化、抗抑郁、免疫調(diào)節(jié)和補(bǔ)血等方面藥理活性[14]。黃芩苷具有抗腫瘤，抗炎，對肝、肺、腦損傷的修復(fù)保護(hù)等作用[15]。選擇這兩個指標(biāo)成分研究達(dá)原飲在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征具有代表性，對闡明達(dá)原飲的體內(nèi)過程具有顯著意義。

本研究首次借鑒和利用先進(jìn)的LC-MS/MS和現(xiàn)代藥動學(xué)技術(shù)，選取芍藥苷和黃芩苷兩個成分研究達(dá)原飲復(fù)雜體系的藥代動力學(xué)特征。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠灌胃給予達(dá)原飲方后，方中芍藥苷和黃芩苷的藥代動力學(xué)特征與其它研究比較，沒有發(fā)現(xiàn)顯著性差異，結(jié)果表明達(dá)原飲方中其它藥味沒有影響芍藥苷和黃芩苷在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征。該研究結(jié)果對于闡明該復(fù)方的體內(nèi)經(jīng)時變化和作用機(jī)制具有非常重要的意義，該研究證明芍藥苷和黃芩苷是達(dá)原飲中能夠通過體內(nèi)的生物屏障進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的藥物分子，因此二者均具備是達(dá)原飲藥效物質(zhì)基礎(chǔ)且具有與藥效關(guān)聯(lián)的生物活性的可能性[16]。對于創(chuàng)新中藥的開發(fā)和中藥合理用藥打下良好基礎(chǔ)。

綜上，本研究建立的大鼠血漿中芍藥苷和黃芩苷同時測定的LC-MS/MS方法可滿足臨床前藥代動力學(xué)研究中對于方法學(xué)驗(yàn)證的要求，該方法靈敏，簡便易行，適用于達(dá)原飲的藥代動力學(xué)研究，并可以在相關(guān)臨床研究中推廣。