基于代謝組學方法的兩株釀酒酵母菌胞內差異代謝產物分析

歐科，陳福欣，王婷，馮光文，嚴貝貝，白巧秀，錢衛東，毛培宏*

1(新疆大學 物理科學與技術學院， 放射生態與離子束生物技術中心，新疆 烏魯木齊，830046)2(西安科技大學 化學與化工學院，陜西 西安，710054)3(陜西科技大學 食品與生物工程學院，陜西 西安，710032)

1 材料與方法

1.1 菌株

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)N6076來源于低能氮離子注入介導外源DNA隨機轉化釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)Kh08獲得的遺傳穩定的產醌類物質的重組酵母菌，由新疆大學物理科學與技術學院放射生態與離子束生物技術中心保存。

1.2 培養基

YPD斜面培養基(g/L)：酵母膏10，蛋白胨20，葡萄糖20，瓊脂粉10g。

液體培養基(g/L)：葡萄糖·H2O 80, 蛋白胨10，酵母膏粉5，KH2PO41.5，MgSO4·7H2O 0.5，pH自然。

1.3 實驗方法

將YPD斜面培養基上培養48 h的新鮮菌種置于4 ℃保存24 h后接種至液體培養基中，置搖床150 r/min、28～30 ℃發酵96 h。分別于0、48和96 h收集菌液 5 mL于離心管內，3 000 r/min離心3 min，棄上清液，在菌體細胞中立即加入5mL淬滅液(V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=2∶2∶1)，充分混勻，-80 ℃冰箱內淬滅10 min。然后于4 ℃、10 000×g離心5 min，棄上清液。加入1 mL、-20 ℃的提取液(V(甲醇)∶V(氯仿)∶V(水)=2∶2∶1)，加等體積SiO2beads，加液氮反復凍融，最大速度渦振3次，使菌體細胞充分破碎。在進行胞內產物制備過程中，樣本置于冰中，保證代謝產物的穩定。

將菌體破碎液，于4℃、10 000×g離心5 min，收集上清，N2常溫吹干，復溶于0.5 mL、-20℃的萃取液(V(乙腈)∶V(水)=1∶1)，再于4 ℃、10 000×g離心5 min。收集上清，N2常溫吹干，-80 ℃凍存。在進行UPLC-Q-TOF/MS和LC-MS/MS檢測時，復溶于200 μL的溶液(V(乙腈)∶V(水)=7∶3)中即可。

本研究設置3個生物學重復，每個生物學重復的0、48、96 h的樣品均設置6個技術重復。

1.4 色譜與質譜檢測條件

UPLC-Q-TOF/MS(超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜儀，德國Bruker公司 Maxis plus)離子源：ESI; 檢測模式：ESI+；毛細管電壓：3 500 V，離子源溫度：200 ℃；氣體流速設定為8 L/min，霧化氣體設置為4 bar。m/z掃描范圍為50～2 000。數據采集速率設置為0.2 s，延遲0.1 s。色譜柱：C18(Waters BEH，50 mm × 2.1 mm，1.7 μm)；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL，流速：0.20 mL/min。流動相A(V(乙腈)∶V(水)=5∶95+0.1%甲酸，流動相B為純乙腈+0.1%甲酸)。梯度洗脫：0～2 min(100%A)，2～24 min(100%～1%A)，24～28 min1%A)，28～29 min(1%～100%A)，29～30 min(100%A)。質量軸以甲酸鈉為校準液，以確保準確度和重現性。

LC-MS/MS(高效液相色譜-質譜/質譜聯用儀，Waters XEVO-TQD，美國Waters公司)的離子掃描模式為MRM掃描模式，正離子檢測，母離子：229.235 8；子離子：131.340 0；錐孔電壓：14 V；碰撞電壓：8 V。色譜柱：C18 (Waters BEH，50 mm × 2.1 mm，1.7 μm)；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL，流速：0.20 mL/min。流動相A(水+0.1%的甲酸)，流動相B(乙腈+0.1%的甲酸)；梯度洗脫：0～1 min(100%A) 1～3.5 min(100%～1%A)，3.5～4.5 min(1%A)，4.5～4.9 min(1%～100%A)，5 min(100%A)。LC-MS/MS定量分析用的MVAP標準品購自Sigma-Aldrich公司，純度>99%。

進入20世紀，由于人口和社會需求急速增加，以美國、前蘇聯、澳大利亞、巴基斯坦、印度及中國等為代表的國家，都通過跨流(區)域的調水來重新分配水資源，以緩解缺水地區經濟發展的用水需求，促進社會經濟發展，滿足社會需求[28-29]。隨著湖泊生態與環境問題的日益凸顯，引水調控工程對受水湖泊的生態與環境效應也逐漸受到關注。

2 結果與分析

2.1 酵母菌胞內代謝物的UPLC-Q-TOF/MS定性分析

2株酵母菌不同發酵時間的胞內代謝物的UPLC-Q-TOF/MS檢測數據用Data Analysis程序轉換為CDF格式，進行XCMS-Online分析[7]，分析結果導入SIMCA-P，利用PLS-DA進行代謝物的鑒定。

分析結果表明，重組菌株N6076的PLS-DA模型中R2X=0.492，R2Y=0.999，Q2=0.745； 原始菌株Kh08的PLS-DA模型中，R2X=0.361，R2Y=0.999，Q2=0.605。2株酵母菌PLS-DA模型的R2Y與Q2均>0.5，說明PLS-DA模型能夠較好的預測2個菌株的胞內代謝物的差異。PLS-DA模型的200次排序檢驗驗證結果如圖1所示，其回歸線的斜率較大，且與縱坐標的截距小于零，說明模型質量較好，沒有出現過于擬合的狀況。

a-N6076;b-Kh08圖1 重組酵母菌N6076與原始菌株Kh08的PLS-DA的模型置換檢驗圖Fig.1 The PLS-DA model permutations test of metabolitesin recombinant yeast strain N6076 and original strain Kh08

在進行代謝物PLS-DA分析時，將每株菌0 h的代謝產物分為一組，48與96 h的分為一組。代謝物PLS-DA分布圖(圖2)顯示，重組菌株N6076與其原始菌株Kh08的胞內代謝物的分離效果較好，每個菌株的48和96 h的代謝物與其0 h的有明顯差異。重組菌株N6076的胞內代謝物，從第一主成分看，0 h組分布在負軸位置，48與96 h組主要分布正軸位置；從第二主成分看，0 h組主要分布在負軸上，48與96 h組分布于正負軸兩側。而原始菌株Kh08代謝物，從第一主成分看，0 h組的都分布在負軸上，48與96 h組分布在正軸上；從第二主成分看，0 h組主要集中在負軸，48與96 h組主要集中在正軸上。

a-N6076;b-Kh08圖2 重組酵母菌N6076與其原始菌株Kh08的代謝物PLS-DA分布圖Fig.2 Score plot of metabolites in recombinant yeast strain N6076 and original strain Kh08

選取VIP>1、P<0.05的代謝物差異點進行代謝物的PLS-DA載荷分析，結果顯示了重組酵母菌N6076與其原始菌株Kh08代謝物的不同主成分的分布，距離中心越遠的代謝物，其差異越大(圖3)。2株酵母菌胞內代謝物在PLS-DA中的載荷均呈橢圓形分布，對差異貢獻最大的點分別分布在第一主成分與第二主成分的正負軸兩端(即橢圓的兩端)。

a-N6076;b-Kh08圖3 重組酵母菌N6076與其原始菌株Kh08的代謝物PLS-DA載荷圖Fig.3 Loading plot of metabolites in recombinant yeast strain N6076 and original strain Kh08

2.2 酵母菌胞內代謝物的種類

UPLC-Q-TOF/MS測試結果(圖4和圖5)顯示，重組菌株N6076的小分子代謝物的種類平均為88種，原始菌株Kh08的小分子代謝物平均為83種。重組菌株N6076的0與48 h的小分子代謝物的質荷比(m/z)大部分在170～850，96 h的小分子代謝物含有m/z>900的化合物。而原始菌株Kh08的48 h小分子代謝物就含有m/z>900的代謝產物。這說明，重組菌株中分子量>900的小分子代謝產物的生物合成時間較原始菌株延遲了48 h。對于重組菌株N6076中出現的質荷比為906.823 8、945.593 2、987.640 1的物質，尚沒有相關報道，其性質有待進一步研究。

a-菌株N6076 48 h樣本；b-菌株Kh08 48 h樣本；c-菌株N6076 96 h樣本；d-菌株Kh08 96 h樣本圖4 重組菌株N6076及其原始菌株Kh08胞內代謝產物的UPLC-Q-TOF/MS部分質譜圖Fig.4 Partial UPLC-Q-TOF/MS Mass Spectrogram of intracellular metabolites of recombinant yeast strain N6076 and original strain Kh08

圖5 重組菌株N6076及其原始菌株Kh08胞內代謝產物的UPLC-Q-Tof/MS色譜圖Fig.5 UPLC-Q-Tof/MS chromatogram of intracellular metabolites of recombinant yeast strain N6076 and original strain Kh08

2.3 重組菌株N6076與原始菌株Kh08胞內代謝物的差異分析

將統計分析得到的重組菌株N6076與原始菌株Kh08胞內代謝物進行相互比較分析，獲得了2株酵母菌株的差異代謝物，分別將其質譜信息與HMDB數據庫進行比對，確定了酵母菌的胞內差異化合物，其中重組菌株N6076的差異化合物為11種(表1)，原始菌株Kh08的差異化合物為10種(表2)。

在2株酵母的胞內代謝差異物中，根據HMDB中的超級分類，重組菌株N6076代謝差異物中有7種脂類物質，原始菌株Kh08中有6種，在已鑒定出的差異物中占比很高。差異物豐度圖(圖6、圖7)的結果顯示，在重組菌株N6076中，脂類物質1-花生酰甘油三酯、4-O-methylmelleolide、β-谷甾醇乙酸酯、單甲基磷脂胺的濃度較高，且β-谷甾醇乙酸酯在各個樣本中都是在96 h時濃度最高。在原始菌株Kh08已鑒定的差異物中，脂類物質 PG(25∶0)、β-谷甾醇乙酸酯、PE(22∶2/15∶0)濃度最高。

表1 重組菌株N6076中的差異化合物Table 1 The differential compounds in recombinant yeast strain N6076

表2 原始菌株Kh08中的差異化合物Table 2 The differential compounds in original strain Kh08

圖6 重組菌株N6076中差異物的豐度圖Fig.6 The abundance diagram of differential compounds in recombinant yeast strain N6076

圖7 原始菌株Kh08中差異物的豐度圖Fig.7 The abundance diagram of differential compounds in original strain Kh08

在重組菌株N6076的差異物中，差異倍數最大的是甲羥戊酸-5-磷酸。甲羥戊酸-5-磷酸(mevalonate-5-phosphate,MVAP)，又稱甲戊酸-5-磷酸或5-磷酸甲戊酸，屬于單烷基磷酸酯類化合物，為甲羥戊酸途徑中重要的中間產物，是合成類異戊二烯、萜類和醌類物質的前體[8]。研究表明，MVAP為甲羥戊酸途徑的重要中間產物，參與了細胞內許多酶促反應，是萜類和醌類等次生代謝產物合成的前體物質[9-12]。萜類化合物在食品中有重要的應用,可用作香精香料、甜味劑、營養強化劑等[13]。MVAP對重組菌株N6076的差異代謝物貢獻最大，說明該菌株的甲羥戊酸代謝途徑活躍，有利于次生代謝產物的合成。

在原始菌株Kh08的差異物中，差異倍數最大的是胱氨酸[14]。從KEGG數據庫的胱氨酸代謝通路可知，其生物合成前體為S-腺苷-L-高半胱氨酸，而含有半胱氨酸的小分子肽具有較高的抗氧化活性[15]。在食品、藥品中有抗氧化和防止非酶褐變作用, 常用作抗氧化劑或營養強化劑[16]。這暗示原始菌株Kh08的抗氧化能力優于重組菌株N6076。

2.4 MVAP的定量分析

利用LC-MS對MVAP進行定量測試，標準溶液的MVAP濃度梯度分別為50.0、25.0、12.5、10.0、5.0、1.0 μg/mL，擬合獲得標準曲線為：y=1 669.72x-23 031.82；r=0.996 724，r2=0.993 458。

檢測結果表明，重組菌株N6076發酵48h時，其胞內MVAP的質量濃度達到1.32 μg/mL，其MRM質譜圖如圖8所示，而原始菌株Kh08在相同發酵時間點時，其胞內MVAP未檢出。對于這種情況的出現，到底是由甲羥戊酸途徑中MVAP合成酶基因的改變造成的還是MVAP上游代謝相關基因調控的，還需進一步研究。

圖8 重組菌株N6076發酵48 h胞內MVAP的MRM圖譜Fig.8 MRM mapping of intracellular MVAP of recombinant strain N6076 fermented for 48 h

3 結論

UPLC-Q-TOF/MS的測試分析結果表明，重組菌株N6076代謝產物中分子質量>900的小分子化合物的合成時間較原始菌株Kh08延遲了48 h。

2株酵母菌胞內代謝物的相互比較分析結果顯示，重組菌株N6076的差異化合物為11種，原始菌株Kh08的差異化合物為10種。這些差異代謝物中，脂類物質多，且豐度高，其中MVAP和胱氨酸分別是2株酵母菌最大的差異代謝物。

LC-MS測試結果，重組菌株N6076在48 h時，其胞內MVAP質量濃度達到1.32 μg/mL，而在原始菌株Kh08中未檢出。

重組菌株N6076中脂類物質種類多于原始菌株Kh08，且濃度相對也高，而且存在合成萜類物質的MVAP，有利于次生代謝產物的合成[17]。原始菌株Kh08的代謝產物中存在胱氨酸，在抗氧化上更有優勢[18]。