小檗堿調(diào)節(jié)PI3K/AKT/FOXO1/Bim信號通路改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷

劉 青，汪佳佳，胡亞琴，唐麗琴,2，魏 偉

(1. 安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點實驗室，抗炎免疫藥物安徽省協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230032；2. 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)藥劑科，安徽 合肥 230001)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一[1]。這種疾病是由于伴隨持續(xù)高血糖和DM狀態(tài)下的血流動力學(xué)因素，導(dǎo)致腎小管、腎小球或腎間質(zhì)的損害[2]。DN的主要病理特征是腎小球結(jié)構(gòu)肥大、腎小球基底膜增厚、腎小管間質(zhì)擴(kuò)張以及細(xì)胞外基質(zhì)成分(如膠原蛋白和纖連蛋白)的異常積聚[3]。足細(xì)胞是終末分化的上皮細(xì)胞，其形成交叉的足突，構(gòu)成腎小球濾過屏障，是阻止蛋白質(zhì)滲漏的關(guān)鍵組分。足細(xì)胞損傷、去分化和丟失是DN的病理標(biāo)志[4]。足細(xì)胞凋亡是DN的早期病理表現(xiàn)，因此足細(xì)胞凋亡可能在DN病理機(jī)理中起到關(guān)鍵作用[5]。PI3K/Akt/FOXO信號通路在細(xì)胞存活和凋亡中起到了重要作用，F(xiàn)OXO被Akt在Thr24、Ser256、Ser319上磷酸化，促進(jìn)它們的出核轉(zhuǎn)運和轉(zhuǎn)錄激活[6]。越來越多的證據(jù)表明FOXO1具有抑癌作用，因為它在多種癌癥中具有抗增殖和促凋亡活性[7]。小檗堿(berberine，BBR)是從黃連中提取的天然化學(xué)物質(zhì)，BBR具有多種生物學(xué)和藥理學(xué)活性，包括抗腫瘤、抗炎和抗氧化應(yīng)激作用，BBR也被證明具有抗糖尿病作用[8]。研究證明小檗堿能明顯改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷[9]，因此本實驗的目的是探討B(tài)BR通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/FOXO1/Bim信號通路改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷，為臨床DN的治療打下基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞小鼠腎小球足細(xì)胞株(BNCC 337685)，購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.2 藥物BBR由安徽省立醫(yī)院藥劑科藥學(xué)實驗室提取純化，經(jīng)RP-HPLC法檢測純度大于96.5 %。精密稱取40.365 g BBR粉末，加入10 mL生理鹽水，加熱渦旋混勻至完全溶解，配制成濃度為1.2×104μmol·L-1的BBR儲備液，用0.22 μm無菌過濾器過濾除菌后冷凍保存。使用前加熱溶解，稀釋到所需濃度即可用于實驗。

1.3 試劑細(xì)胞計數(shù)試劑盒(CCK-8，貨號K1018)，美國Protech公司；RPMI 1640培養(yǎng)液(貨號：11875)，Thermo Fisher科技公司；凋亡試劑盒(貨號AP101)：聯(lián)科生物公司；胎牛血清：Biological Industries公司；六孔細(xì)胞培養(yǎng)板，Corning公司；WT-1(Rabbit Antibody，貨號sc-19232026)，Santa Cruz生物科技公司；PI3K(Rabbit Antibody，貨號4249)、AKT(Rabbit Antibody，貨號4691S)、p-AKT(Rabbit Antibody，貨號4060S)、FOXO1(Rabbit Antibody，貨號2880)、p-FOXO1(Rabbit Antibody貨號9461)、Bim(Rabbit Antibody，貨號2933)，Cell Signaling公司；nephrin(Rabbit Antibody，貨號ab85379)，Abcam公司。

1.4 儀器電泳儀(型號DYY-10)：北京六一儀器廠；可調(diào)水平搖床(型號STS-1)：上海琪特分析儀器有限公司； PH檢測計(型號PHS-3C)：上海雷磁儀器廠；酶標(biāo)儀(型號BioTek Elx×808)，美國BioTek公司；純水儀(型號HB-RO/05)：杭州惠邦凈水設(shè)備有限公司；Eppendorf Research plus 移液器(型號31200000)：Eppendorf科技公司；化學(xué)發(fā)光成像分析儀(型號Image Quant Las 4 000 mini)，美國 GE Healthcare Life Sciences公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將液氮中凍存的細(xì)胞于37 ℃水浴中融解離心，在RPMI 1640基礎(chǔ)培基中加入10% FBS、1% 雙抗、0.2% γ干擾素用于培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞于5% CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 CCK-8檢測取指數(shù)生長期的腎小球足細(xì)胞進(jìn)行實驗，96孔培養(yǎng)板加入足細(xì)胞單細(xì)胞懸液200 μL/孔(約含一萬個細(xì)胞)，各組另設(shè)5個平行組；待細(xì)胞貼壁完全后，正常對照組(Control，11.1 mmol·L-1葡萄糖)、高糖模型組(HG，30 mmol·L-1葡萄糖)和BBR給藥組按照分組給予對應(yīng)的培基，BBR給藥組的濃度設(shè)置為：15、30、60、90、120 μmol·L-1。給藥24 h后，CCK-8溶液的用量為10 μL/孔。培養(yǎng)板避光繼續(xù)培養(yǎng)，每隔1 h用酶標(biāo)儀震蕩后測定各組在450 nm處的吸光度，一次實驗結(jié)果取平均值，重復(fù)實驗3次。

2.3 細(xì)胞凋亡采用Annexin V- FITC/PI雙染實驗觀察小檗堿對高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的影響，足細(xì)胞貼壁后分為5組，按照分組給予對應(yīng)的培基，BBR給藥組濃度設(shè)置為：30、60、90 μmol·L-1，給藥24 h后，消化離心并收集1×105～5×105個細(xì)胞。接著每管先加入500 μL稀釋5倍的Binding buffer，再加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI溶液，室溫靜置避光孵育5 min后轉(zhuǎn)移到流式管中，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

2.4 Transwell小室檢測細(xì)胞遷移能力將Transwell小室放于24孔板中，下室分組及加藥處理同2.3項，并加入15%血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，上室每孔加入一萬個5% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基的足細(xì)胞單細(xì)胞懸液，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用5% 結(jié)晶紫染色，用PBS洗去多余的結(jié)晶紫，用棉簽擦去Transwell上室未遷移的細(xì)胞，在倒置顯微鏡下拍照并觀察結(jié)果。每個樣本隨機(jī)選取5個視野，計算每個視野的細(xì)胞數(shù)。

2.5 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)足細(xì)胞消化計數(shù)后按1×108/孔加到6孔板上，細(xì)胞貼壁后分組及加藥處理同2.3項，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，用預(yù)冷的PBS輕柔洗滌兩次去除死細(xì)胞及雜質(zhì)后，每孔加入100 μL現(xiàn)配的預(yù)冷裂解液，置冰上30 min后刮下細(xì)胞，離心收集上清液，加入蛋白上樣緩沖液，得到上樣蛋白。在配好的SDS-PAGE凝膠上用微量注射器上樣，然后完成跑膠、轉(zhuǎn)膜、封閉步驟，用目的蛋白抗體孵育過夜，3遍TPBS洗膜后將PVDF膜于適合濃度的二抗工作液-牛奶中37 ℃孵育1 h；顯影后進(jìn)行灰度圖分析得結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 BBR對足細(xì)胞增殖的影響Fig 1結(jié)果顯示，高糖模型組與正常對照組相比，足細(xì)胞的存活率明顯降低(P<0.01)；BBR(30、60、90 μmol·L-1)作用組與高糖模型組相比，能明顯促進(jìn)足細(xì)胞增殖。因此后續(xù)實驗選擇了BBR 30、60、90 μmol·L-1這3個濃度進(jìn)行實驗。

Fig 1 Effect of BBR on proliferation of

##P<0.01vscontrol group:*P<0.05,**P<0.01vsHG group.

3.2 BBR對足細(xì)胞凋亡率的影響Fig 2結(jié)果顯示，高糖模型組與正常對照組相比，足細(xì)胞的凋亡率有較明顯提高(P<0.01)；BBR(30、60、90 μmol·L-1)作用組與高糖模型組比較能明顯降低足細(xì)胞的凋亡率。

Fig 2 Effect of BBR on apoptosis of

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsHG group.

3.3 BBR對足細(xì)胞遷移能力的影響Fig 3結(jié)果表明，高糖模型組與正常對照組相比， Transwell下室的足細(xì)胞數(shù)量明顯增加(P<0.01)；BBR(30、60、90 μmol·L-1)作用組與高糖模型組相比，Transwell下室的足細(xì)胞數(shù)量明顯減少。

Fig 3 Effect of BBR on migration of

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsHG group.

3.4 BBR對高糖作用后足細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響PI3K/AKT/FOXO1/Bim信號通路被認(rèn)為是細(xì)胞存活和凋亡的重要調(diào)控因子。Fig 4結(jié)果顯示，與正常對照組相比，高糖模型組中足細(xì)胞上PI3K、p-AKT和Bim蛋白表達(dá)量明顯升高(P<0.01)，p-FOXO1的蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.01)，并且BBR(30、60、90 μmol·L-1)作用組能夠有效降低足細(xì)胞上PI3K、p-AKT和Bim蛋白表達(dá)水平，能夠有效升高足細(xì)胞上p-FOXO1蛋白表達(dá)水平。

3.5 BBR對足細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響維持足細(xì)胞功能完整性的重要蛋白有nephrin、WT-1。Fig 5的Western blot的灰度值結(jié)果顯示，高糖模型組與正常對照組相比，nephrin、WT-1蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.01)，與高糖模型組相比，BBR(30、60、90 μmol·L-1)作用組的nephrin和 WT-1蛋白表達(dá)量明顯升高。

Fig 4 The expression levels of Bim,PI3K/β-actin and

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsHG group.

Fig 5 The expression levels of nephrin and WT-1 tested

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsHG group.

4 討論

足細(xì)胞是腎小球基底膜選擇性通透性屏障的關(guān)鍵組成部分，DM誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡導(dǎo)致腎小球濾過屏障功能減弱，這可能導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生[10]。足細(xì)胞通過狹縫隔膜連接并覆蓋腎小球基底膜的表面以調(diào)節(jié)滲透性。它包裹毛細(xì)血管形成過濾縫，可以保持腎小球濾膜的結(jié)構(gòu)完整性，足細(xì)胞丟失是導(dǎo)致包括糖尿病腎病在內(nèi)的一些腎病進(jìn)展的關(guān)鍵因素。在DN期間，由于足突的喪失，足細(xì)胞在高血糖癥中發(fā)生脫離。WT-1和nephrin是維持細(xì)胞骨架的重要分子，細(xì)胞骨架在足細(xì)胞損傷過程中被下調(diào)，此外，結(jié)蛋白是另一種細(xì)胞骨架蛋白，在足細(xì)胞損傷過程中會上調(diào)。在本研究中，我們使用30 mmol·L-1葡萄糖成功建立了足細(xì)胞損傷模型，正如WT-1和nephrin的下調(diào)所證明[11]。

哺乳動物叉頭盒O(FOXO)家族包括四個成員：FOXO3，F(xiàn)OXO4，F(xiàn)OXO6和FOXO1。 FOXO成員在多種細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用，如腫瘤抑制、糖尿病并發(fā)癥、細(xì)胞周期停滯、DNA修復(fù)、傷口愈合、免疫、代謝調(diào)節(jié)和細(xì)胞分化，F(xiàn)OXO1是一種轉(zhuǎn)錄因子，在氧化應(yīng)激、細(xì)胞代謝、增殖和凋亡中起重要作用，并且有證據(jù)表明FOXO1的表達(dá)與絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt信號傳導(dǎo)途徑有關(guān)，F(xiàn)OXO1是AKT的下游基因[12]。FOXO轉(zhuǎn)錄因子受上游PI3K/Akt磷酸化級聯(lián)調(diào)節(jié)，其中FOXO1在腎損傷的發(fā)病機(jī)理中起重要作用，并且FOXO1從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至核激活，p-FOXO1的增加將減少FOXO1的核轉(zhuǎn)位，抑制凋亡基因Bim的表達(dá)，防止細(xì)胞凋亡的發(fā)生[13]。BBR是一種從黃連中分離出來的異喹啉生物堿，BBR具有多種藥理活性，如降低血糖和抗氧化應(yīng)激，抑制炎癥，因此BBR是DN治療中的潛在治療藥物[14]。本實驗在體外用高糖刺激足細(xì)胞，并使用不同濃度的BBR觀察BBR緩解足細(xì)胞損傷的機(jī)制，通過觀察足細(xì)胞的凋亡、遷移、足細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)、足細(xì)胞上PI3K/AKT/FOXO1/Bim信號通路的蛋白表達(dá)，得出BBR在高糖環(huán)境下可以降低足細(xì)胞的凋亡率、減少足細(xì)胞遷移、提高足細(xì)胞標(biāo)志性蛋白的表達(dá)，并且可以有效降低高糖環(huán)境下足細(xì)胞上PI3K、p-AKT和Bim蛋白表達(dá)水平，有效升高足細(xì)胞上p-FOXO1蛋白表達(dá)水平，從而改善足細(xì)胞的損傷。

綜上所述，高糖環(huán)境激活PI3K/AKT信號通路，進(jìn)而影響了FOXO1從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至核被磷酸化，未被磷酸化的FOXO1促進(jìn)凋亡基因Bim的表達(dá)，促進(jìn)足細(xì)胞的凋亡，實驗結(jié)果顯示，BBR能調(diào)節(jié)此過程。因此，本實驗揭示了BBR可能通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/FOXO1/Bim信號通路改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。