ACE2小干擾RNA對平滑肌細胞AT1受體蛋白表達及其下游信號通路的影響

龔晶婧，李榮通，盧卓強，許昌聲，王華軍，晉學慶

(1.福建醫科大學附屬第一醫院心內科,2.福建省高血壓研究所，3.福建醫科大學附屬第一醫院干部病房，福州 350004)

腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensinsystem，RAS)是人體內重要的內分泌系統，在調節機體水電解質平衡、血壓穩定及心腎功能方面起著舉足輕重的作用，其成員主要包括腎素、血管緊張素原、血管緊張素轉換酶以及血管緊張素Ⅰ、 Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ等。其中血管緊張素Ⅱ(angiotensionⅡ，AngⅡ)為該系統發揮上述作用的重要效應分子，在平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)上與其l型受體(AngⅡ type 1 receptor，ATlR)結合后，經絲裂原激動蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)等多條信號通路后啟動VSMCs的增殖、細胞肥大等，最終導致血管收縮、血壓升高及心肌肥厚等心血管病理改變。[1]

2000年,Donoghue等和Tipnis等幾乎同時分別從人淋巴瘤和擴心病心衰患者左心室組織的cDNA文庫中克隆出與人類血管緊張素轉化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)相關的羧肽酶[2],稱之為ACE2。目前人類ACE2基因已被定位于X染色體Xp22位點上，基因全長40kb，含有18個外顯子，其中17個與ACE外顯子大小、結構、形態相似，表明二者來自同一祖先基因[2]。此外，與ACE的全身廣泛分布不同，ACE2在器官水平上主要分布于心臟、腎臟及睪丸，細胞水平上主要分布于心臟、腎臟血管的內皮細胞[2]，此外還在胃腸道、腦、肺里有少量分布。 ACE2催化產物Ang-(1-7)與其特異性受體Mas結合后具有降低血壓、調節機體水鹽平衡、抗心肌肥厚、逆轉心室重構等重要心血管保護功能[3]，因此ACE2主要作用是一方面增加AngⅡ的降解而減少AngⅡ導致的細胞增殖、肥大、血管收縮等不利效應,另一方面通過生成Ang(1-7)與其特異受體Mas結合舒張血管、抑制細胞增殖而發揮拮抗AngⅡ的作用。由此發現RAS另一分支:ACE2-Ang(1-7)-Mas軸，且其與傳統的ACE-AngⅡ-ATlR軸二者相互拮抗、平衡，對維持血壓和心血管正常結構及功能有重要意義。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)為一種由雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)誘發的基因沉默現象，與dsRNA具有同源序列的mRNA被降解，從而達到抑制該基因的表達。是生物體進化過程中由于基因重復序列、基因突變及病毒感染等所引起基因組不穩定的保護機制。對RNA干擾現象的最初認識是1998年Fire和Blello用線蟲和果蠅實驗所得[4]。RNAi具有高度特異性、高效性、遺傳性、高度穩定性等特點。目前，隨著對RNAi技術研究的深入，表明其在基因功能、基因表達、基因治療以及藥物篩選等領域有著廣闊的應用前景。因此，本研究運用RNAi技術，探討ACE2蛋白表達變化對ATl受體、ERK1/2蛋白、STAT3蛋白磷酸化水平的影響及其可能機制，初步探討ACE2拮抗AngⅡ的生物學作用機制，為探索心血管疾病治療機制盡可能開辟新的研究領域。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和試劑盒細胞培養液DMEM和胎牛血清購自Invitrogen公司，AngⅡ、ACE2 siRNA購自Sigma公司(美國)，兔抗大鼠ACE2一抗、兔抗大鼠ATlR一抗(英國Abcam公司)。兔抗大鼠p-ERK1/2、ERK1/2、p-STAT3、STAT3一抗(美國CST公司)，小鼠β-actin一抗、羊抗大鼠和小鼠二抗(美國Santa Cruz公司)。DMEM培養基、胎牛血清(美國Gibco公司)。

1.2 實驗動物及慢病毒體質量為(120～130) g普通成年SD ♂大鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物使用許可證號：SCXK(滬)2007-0005。慢病毒重組ACE2表達載體購自上海吉凱因化學技術有限公司。

1.3 儀器低溫高速離心機(德國Sigma公司)，垂直電泳儀(美國BioRad公司)。

1.4 SD大鼠胸主動脈VSMC的培養SD大鼠胸主動脈VSMC采用組織貼塊法培養。

1.5 實驗分組① 空白對照組; ② GFP組; ③ 脂質體組; ④ ACE2組; ⑤ si-ACE2組; ⑥ AngⅡ 組; ⑦ AngⅡ+ACE2組; ⑧ AngⅡ+ACE2+si-ACE2組; ⑨ AngⅡ+si-ACE2組; ⑩ scrambled si-RNA組。

1.6 si-ACE2的制備ACE2的小干擾RNA(si-ACE2)由Sigma公司合成，與ACE2 mRNA堿基序列配對，G/C含量在30%～70%之間，并在每條單鏈3′端外帶兩個T堿基，再與編碼鏈形成雙鏈。用0.1%的DEPC水稀釋至濃度20 μmol·L-1，-20℃保存。ACE2小干擾RNA的堿基序列：5′-GATAACTTAGTCCCCTCCTTCCTT-3′,5′-GGAAGGAGGGGACUAAGUUAUCTT-3′,si-ACE2各組，按如下步驟準備si-RNA-lipo2000混合液(試劑的用量和體積參照小干擾RNA說明書)：① 稀釋轉染試劑：lipofectamine2000(簡稱lipo2000)： 取不含胎牛血清的DMEM培養基100 μL稀釋2 μL lipo2000，輕輕混合，室溫孵育5 min；② 稀釋si-RNA：取不含胎牛血清的DMEM培養基100 μL稀釋2.5 μL siRNA(終濃度50 nmol·L-1)，輕輕混合；③ 稀釋好的lipo-2000經過孵育后與上述混好的si-RNA輕輕搖晃，使之混勻，室溫孵育20～30 min。

1.7 細胞的接種、轉染、干預取第三代平滑肌細胞按1×105/孔種植于12孔板，并加入1 mL含20%胎牛血清DMEM培養基，直至孔板內細胞長滿50%左右，將所有細胞隨機分組(分組方法詳見實驗分組)。Lentiviral-GFP組感染條件：5 μL(1 mg·mL-1) polyprene,975 μL 20%完全培養液DMEM，20 μL (1×108TU·mL-1)病毒液； Lentiviral-ACE2組各組感染條件：5 μL (1 mg·mL-1) polyprene,975 μL 20%完全培養液DMEM， 20 μL (1×108TU·mL-1) 病毒液；各si-ACE2組加入上述制備好的siACE2-lipo2000混合液，輕輕搖晃使之混勻；脂質體組僅加入lipo2000；scrambled siRNA組轉染步驟同各siACE2組。各組感染終體積均為1 mL。Lentiviral-ACE2轉染96 h，AngⅡ干預濃度為10-7mol·L-1，干預8 h，培養72 h。

1.8 Western blot測定各組ACE2、AT1R蛋白表達、ERK1/2蛋白和STAT3蛋白磷酸化水平將上述各組干預培養72 h后，將培養液倒掉，在每孔中加入200 μL RIPA(組成：50 mmol·L-1Tris-HCl pH 7.4，150 mmol·L-1NaCl，1%NP-40，0.1% SDS)，提取蛋白。10%的SDS-PAGE電泳、轉膜，5%的脫脂奶粉室溫下封閉1 h，加入兔抗大鼠ACE2(1 ∶500)，兔抗大鼠ATIR(1 ∶800)，兔抗大鼠p-STAT3、STAT3(1 ∶800)，4 ℃過夜，用TBST(組成：1 mol·L-1Tris-HCl 10 mL pH 7.4，NaCl 8.8 g，吐溫20 0.05%)洗3次，每次10 min。加入二抗(1 ∶1 500)，室溫培育1 h，TBST洗3次，每次10 min。顯色、曝光，經Guantity one軟件分析吸光度值(A)，并與內參照的比值作為半定量指標進行比較。

2 結果

2.1 Western blot檢測ACE2的siRNA干預Lentiviral-ACE2轉染的SD大鼠VSMCs后各組ACE2的蛋白表達各組細胞培養72 h后，提取細胞ACE2蛋白，行Western blot檢測各組ACE2蛋白表達量，從Fig 1A可看出：空白對照組、GFP組及脂質體組ACE2蛋白有少量表達，且ACE2組ACE2蛋白表達量為各組中最高，較上述各組明顯升高，差別具有統計學意義，說明病毒載體構建及轉染血管平滑肌細胞成功及其轉染后能明顯提高ACE2蛋白的表達； si-ACE2組ACE2蛋白表達水平則明顯低于空白對照組、GFP組和脂質體組，差異具有統計學意義，表明siRNA能明顯抑制ACE2蛋白的表達；AngⅡ組ACE2蛋白表達量較空白對照組、GFP組及脂質體組亦明顯減少，提示AngⅡ能抑制ACE2蛋白的表達；AngⅡ+si-ACE2組的ACE2蛋白表達水平則明顯低于AngⅡ組；AngⅡ+ACE2+si-ACE2組的ACE2蛋白表達水平則低于AngⅡ+ACE2組，說明siRNA與AngⅡ兩者對ACE2蛋白表達有協同抑制作用。以上各組結果說明各si-ACE2干預組ACE2蛋白表達量較相對應的無si-ACE2干預組明顯減少，表明si-ACE2能明顯抑制ACE2蛋白的表達，且si-ACE2與AngⅡ對ACE2蛋白表達的抑制具有協同作用。

Fig 1 The ACE2 (A) and AT1R (B) protein expression after ACE2 si-RNA interference in VSMCs measured

1. Control group; 2. Lentiviral-GFP group (GFP);3. Lipofectamine 2000 group;4. Lentiviral-ACE2 group;5. si-ACE2 group;6. AngⅡ group;7. AngⅡ+lentiviral-ACE2 group; 8. AngⅡ+lentiviral-ACE2+si-ACE2 group; 9. AngⅡ+siACE-2 group； 10. Scrambled siRNA group.*P<0.05vscontrol,GFP and lipofectamine 2000 group;#P<0.05vsAngⅡ group;##P<0.05vsAngⅡ+ACE2 group.

2.2 ACE2 siRNA干擾后各組VSMC AT1R的蛋白表達量ACE2的siRNA干預后，各組細胞培養3 d后，同樣采用Western blot檢測各組AT1R的蛋白表達量，結果顯示：ACE2組AT1R的蛋白表達量較空白對照組、GFP組、脂質體組明顯下降，差異具有統計學意義，提示ACE2能抑制AT1R的表達； si-ACE2 組和AngⅡ組的AT1R蛋白表達水平則明顯高于空白對照組、GFP組和脂質體組；AngⅡ+si-ACE2 組的AT1R蛋白表達水平則高于AngⅡ組；AngⅡ+ACE2+si-ACE2組的AT1R蛋白表達水平則高于AngⅡ+ACE2組。以上各對比組差異表明隨著ACE2蛋白表達的減少，AT1受體蛋白的表達能上調。

2.3 Western blot檢測各組p-ERK1/2蛋白、p-STAT3蛋白磷酸化水平從Fig 2A、2B可看出，各組細胞經過相關干預后培養72 h后，經Western blot檢測p-ERK1/2蛋白、p-STAT3蛋白磷酸化水平后發現： ACE2組p-ERK1/2蛋白、p-STAT3蛋白磷酸化水平較空白對照組、GFP組及脂質體組明顯低，差異具有統計學意義；AngⅡ+ACE2組的p-ERK1/2蛋白、p-STAT3蛋白磷酸化水平則低于AngⅡ組，表明ACE2能抑制p-ERK1/2蛋白、p-STAT3蛋白磷酸化，而其表達的減少p-ERK1/2蛋白、p-STAT3蛋白磷酸化水平能相應提高；si-ACE2組和AngⅡ組的p-ERK1/2蛋白、p-STAT3蛋白磷酸化水平則明顯高于空白對照組、GFP組和脂質體組；AngⅡ+si-ACE2組的p-ERK1/2蛋白、p-STAT3蛋白磷酸化水平則高于AngⅡ組； AngⅡ+ACE2+si-ACE2組的p-ERK1/2蛋白、p-STAT3蛋白磷酸化水平則高于AngⅡ+ACE2組，以上各si-RNA干擾組p-ERK1/2蛋白、p-STAT3蛋白磷酸化水平較各對應無si-RNA干擾組明顯升高，提示ACE2表達被抑制后能提升p-ERK1/2蛋白、p-STAT3蛋白磷酸化水平。

Fig 2 Level of p-ERK1/2 (A) and p-STAT3 (B) phosphorylation after ACE2 si-RNA interference in VSMCs measured by Western

1. Control group; 2. Lentiviral-GFP group (GFP); 3. Lipofectamine 2 000 group;4. Lentiviral-ACE2 group;5. Si-ACE2 group; 6. AngⅡ group;7. AngⅡ+lentiviral-ACE2 group; 8. AngⅡ+lentiviral-ACE2+si-ACE2 group; 9. AngⅡ+siACE-2 group; 10. Scrambled siRNA group.*P<0.05vscontrol,GFP and lipofectamine 2000 group;#P<0.05vsAngⅡ group;##P<0.05vsAngⅡ+ACE2 group.

3 討論

腎素血管緊張素系統(RAS)主要存在于血液循環或組織中，在維持機體水、電解質平衡、調節血壓及心血管系統細胞增殖過程中起重要的作用，其過度激活是許多心血管疾病始動因素。而AngⅡ作為RAS系統最重要的活性物質，通過與其特異性受體結合，可使血管平滑肌細胞增生、心肌細胞肥大，引起血管壁增厚、血管阻力增大、左心室肥厚、腎臟纖維化等病理改變。研究表明[5,6]AngⅡ主要與ATlR特異性結合,經ERK1/2、JNK/SAPK、p38MAPK、JAK2-STAT等信號路徑調節血管內皮細胞的增殖、血管收縮以及氧化應激等病理生理反應[7]。目前研究表明ACE2主要通過兩種路徑拮抗ACE作用：(1)直接水解AngI產物AngⅡ成Ang(1-7)，減少了AngⅡ濃度，進而減少AngⅡ對靶細胞刺激引起細胞增殖、肥大等病理生理改變； (2)AngⅡ降解產物Ang(1-7)具有舒張血管、降低血壓、抑制血管平滑肌細胞增殖肥大、抑制心肌細胞的肥大、抑制心肌成纖維細胞的增殖等拮抗AngⅡ效應[8]。而Ang(1-7)結合其特異性受體Mas后通過蛋白激酶B(AKT)信號通路、MAPK通路、環單磷酸鳥苷/蛋白激酶G(cGMP/PKG)通路以及鈣信號通路等實現上述拮抗AngⅡ的作用。Deng等[9]研究表明在自發性高血壓大鼠的延髓頭端腹外側區中過表達ACE2明顯降低了乙酰膽堿的釋放,改善了血管內皮細胞的生理功能。本課題組前期研究中通過載有ACE2基因慢病毒表達載體轉染大鼠平滑肌細胞，發現ACE2可以通過下調AT1R和/及ERK1/2的磷酸化水平而抑制平滑肌增殖,提示ACE2的過表達具有血管保護作用[10]。

然而，并不是ACE2表達越高就越好，在ACE2轉基因動物模型研究表明，心肌過度表達ACE2后出現心臟傳導阻滯及室性心律失常，可發展為室顫和猝死，且其嚴重程度與ACE2表達量成正比。Iwata等[11]研究表明,Ang(1-7)與心臟成纖維細胞上Mas受體結合,具有抗心肌肥大、抗纖維化及抑制膠原合成等作用,表明Ang(1-7)能逆轉AngⅡ的不良作用,改善心肌重構功能；而在自發性高血壓大鼠(SHR)、鹽敏感高血壓大鼠(SBH)、自發性高血壓易卒中型(SHRSP)等高血壓大鼠動物模型的QTL定位研究表明，ACE2基因為高血壓相關基因，且在發生高血壓后上述動物模型ACE2mRNA和蛋白均呈低水平表達；在肝星狀細胞中研究表明，Ang(1-7)能夠通過Mas受體抑制AngⅡ激活的ERK信號通路，達到抑制AngⅡ介導的肝臟纖維化[12]。此外多項研究表明，Ang(1-7)通過內皮細胞、產生NO、前列環素及激肽等血管活性物質起到擴張血管作用。以上研究表明ACE2蛋白表達的變化及其平衡在心血管疾病的發生、發展起著重要作用。

本研究利用RNAi技術，用si-ACE2干擾慢病毒轉染ACE2基因的VSMCs后,運用Western blot檢測各組AT1受體蛋白、ERK1/2蛋白、STAT3蛋白的磷酸化水平發現：si-ACE2干擾之后各組AT1受體蛋白的表達量、ERK1/2蛋白、STAT3蛋白的磷酸化水平較各對應無干擾組明顯上升，而與之對應的ACE2蛋白的表達量相應減少。表明si-ACE2干擾之后隨著ACE2蛋白表達的減少，其對AngⅡ誘導的AT1受體蛋白及其下游信號ERK1/2蛋白、STAT3蛋白的磷酸化抑制減弱。本研究結果與Gallagher等[13]研究結果相符，他們研究發現當ACE2表達下調之后AngⅡ濃度升高,通過AT1R誘導細胞ERK1/2蛋白、STAT3蛋白磷酸化水平的提高；此外亦有研究表明在腎小管上皮細胞NRK-52E中，Ang(1-7)通過Mas受體抑制高糖誘導的ERK1/2和p38磷酸化，進而抑制高糖刺激的上皮細胞向間充質細胞轉化[14]。另外，本課題組在既往研究實驗中用慢病毒轉染SD大鼠血管平滑肌細胞，使ACE2基因過表達，發現其除能明顯抑制AngⅡ誘導的VSMC增殖之外亦能抑制AT1受體蛋白表達以及AT1受體下游信號通路的STAT3蛋白、ERK1/2蛋白的磷酸化。上述研究表明，ACE2除了通過分解AngⅡ減少其濃度達到拮抗AngⅡ誘導血管平滑肌增殖作用，亦可以直接影響AT1受體蛋白表達及其下游信號MAPK磷酸化水平抑制AngⅡ作用。

本研究同時也發現，AngⅡ能抑制ACE2蛋白的表達，且AngⅡ與si-ACE2能協同抑制ACE2蛋白表達。Gallagher等[15]在大鼠小腦或延髓星形膠質細胞中研究中表明AngⅡ能夠減少上述細胞中ACE2 mRNA和蛋白的表達50%以上,且該效應同樣能被AT1受體阻斷劑纈沙坦或者氯沙坦所阻斷；而AT2受體阻斷劑PD123319對ACE2 mRNA和蛋白的表達則沒有影響。另外本課題組在早期研究中發現SHR大鼠用纈沙坦治療后，SHR大鼠血壓下降的同時，腎臟中ACE2蛋白表達亦明顯上升并且呈劑量依賴性升高。此外，本研究發現AngⅡ組、AngⅡ+si-ACE2組ERK1/2蛋白、STAT3蛋白磷酸化水平高于各相應對比組。以上實驗表明AngⅡ可能通過影響AT1受體及其下游通路ERK1/2蛋白、STAT3蛋白磷酸化水平調節ACE2蛋白的表達。

總之，本研究表明ACE2-Ang(1-7)-Mas與ACE-AngⅡ-AT1這兩條軸之間在心血管系統相互調節、相互拮抗。除了通過ACE2分解AngⅡ減少其作用、生成Ang(1-7)與其特異性Mas受體結合拮抗AngⅡ引導的血管平滑肌細胞增殖、心肌重構等作用外，亦可以直接通過AT1R-ERK1/2或STAT3信號通路相互拮抗，共同發揮心血管系統的病理生理調節作用，對心血管疾病的治療具有重要指導意義。