白細胞介素-12抗NK/T細胞淋巴瘤的活性及其機制研究

王 媛,惠 雙,張成輝,郭宏強,李 敏,鄭芝欣

(1.南陽市中心醫院腫瘤內科，河南 南陽 473000; 2.鄭州大學第一附屬醫院腫瘤綜合病區，河南 鄭州 450000；3. 南陽市中心醫院藥學室，河南 南陽 473000)

NK/T細胞淋巴瘤屬于非霍奇金淋巴瘤，多起源于結節外部位。結節外NK/T細胞淋巴瘤在亞洲、尤其是中國南方及東南亞地區發病率較高[1]。NK/T細胞淋巴瘤的具有浸潤性生長的特征，病灶內腫瘤細胞增殖、凋亡及細胞周期的異常與該病理特征密切相關[2-3]，但具體的發病機制尚未完全闡明。傳統治療侵襲性非霍奇金淋巴瘤的CHOP方案用于NK/T細胞淋巴瘤治療的效果較差，即使能夠獲得短暫緩解、隨后的復發率也較高，目前臨床上仍缺乏有效的靶向治療NK/T細胞淋巴瘤的手段[4]。

白細胞介素-12(interleukin-12，IL-12)是體內重要的免疫活性細胞因子，能夠促進Th1細胞、NK細胞等免疫細胞的分化及相應細胞因子的分泌，已經在肺癌、乳腺癌、肝癌等惡性腫瘤細胞中被證實具有抗癌作用[5-7]。在不同類型的淋巴瘤患者中，血清IL-12含量的改變與預后不佳密切相關[8]。為了明確IL-12在NK/T細胞淋巴瘤中的治療價值，本實驗以NK/T細胞淋巴瘤細胞株YTS為對象，通過細胞實驗及移植瘤動物實驗分析了IL-12調控YTS細胞的細胞活力、細胞周期、細胞凋亡的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 NK/T細胞淋巴瘤細胞株YTS，購自中科院上海細胞資源中心。

1.1.2動物 SPF級的C57小鼠、♂、(18～20) g購自上海杰思捷實驗動物有限公司，許可證號：生產許可SCXK(滬)2018-0004。飼養環境溫度(18～23) ℃、適度45%～55%、自由飲水攝食。

1.1.3試劑 IL-12(批號：SRP3204)購自Sigma公司，DMEM培養基、胰蛋白酶、胎牛血清購自Gibco公司，陰性對照(NC)siRNA、JAK2 siRNA購自上海吉瑪公司，空白的pcDNA3.1質粒、表達JAK2的pcDNA3.1質粒購自上海生工公司，MTS細胞活力檢測試劑盒(批號：G3580)購自Promega公司，Annexin V/PI凋亡試劑盒(批號：C1062)、RIPA裂解液(批號：P0013)購自上海碧云天公司，結晶紫購自Sigma公司，JAK2(批號：3230)、p-JAK2(批號：3771)、STAT3(批號：9139)、p-STAT3(批號：9145)的單克隆抗體購自CST公司，β-actin(批號：ab179467)的單克隆抗體購自Abcam公司。

1.1.4儀器 細胞培養基購自Thermo公司，正置顯微鏡及倒置顯微鏡購自Olympus公司，電泳系統及化學顯影儀購自上海天能公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養及分組 YTS細胞用含有10%胎牛血清的DMEM貼壁培養，細胞鋪滿90%后用胰蛋白酶進行消化、傳代，傳代后的細胞繼續擴增培養，得到足夠數量的細胞后進行分組。對照組用不含藥物的DMEM處理，IL-12組用含有不同濃度IL-12(0.625、1.25、2.5、5.0、10.0、20.0 ng·mL-1)的DMEM處理，NC siRNA組轉染NC siRNA，JAK2 siRNA組轉染JAK2 siRNA，空白質粒組轉染空白的pcDNA3.1質粒，20.0 μg·L-1IL-12+空白質粒組用含有20.0 μg·L-1IL-12的DMEM處理并轉染空白的pcDNA3.1質粒，20.0 μg·L-1IL-12+JAK2表達質粒組用含有20.0 μg·L-1IL-12的DMEM處理并轉染表達JAK2的pcDNA3.1質粒。連續處理24小時。

1.2.2移植瘤小鼠模型建立及分組 取傳代的YTS細胞、制備濃度為5×107個/mL的細胞懸液，將0.2 mL細胞懸液接種在右側腋窩皮下，7天后捫及米粒大小的腫瘤、提示移植瘤小鼠制備成功，共12只小鼠進行移植瘤制備、制備成功率100%。移植瘤小鼠隨機分為對照組、IL-12組，每組各6只。參照Chi[9]的研究，皮下注射YTS細胞后d 7、9、12、15、19、25時，IL-12組分別給予1 500 U重組人IL-12瘤內注射，第35天時處死、解剖移植瘤并稱重，而后將移植瘤用液氮冷凍、-80 ℃保存。

1.2.3細胞活力檢測 在96孔板內接種YTS細胞，按照分組及給藥方法分為對照組、IL-12組、NC siRNA組、JAK2 siRNA組、空白質粒組、20.0 μg·L-1IL-12+空白質粒組、20.0 μg·L-1IL-12+JAK2表達質粒組并進行處理，處理24 h后，向每個培養孔內加入20 μL MTS試劑盒的檢測液，培養箱中繼續孵育4 h后取出培養板，震蕩后在酶標儀上測定570 nm波長的吸光值、記為OD570。

1.2.4細胞周期檢測 在6孔板內接種YTS細胞，按照分組及給藥方法分為對照組、IL-12組、NC siRNA組、JAK2 siRNA組、空白質粒組、20.0 μg·L-1IL-12+空白質粒組、20.0 μg·L-1IL-12+JAK2表達質粒組并進行處理，處理24 h后，用70%乙醇固定細胞過夜，第二天用50 mg·L-1的碘化丙啶、0.1% Triton X-100避光孵育細胞30 min，最后在流式細胞儀上檢測細胞周期。

1.2.5細胞凋亡檢測 按照1.2.3的方法收集細胞并固定過夜，用Annexin V/PI凋亡試劑盒中的檢測液避光孵育15 min，在流式細胞儀上檢測細胞凋亡率。

1.2.6Western blot檢測 在12孔板內接種YTS細胞并分組處理24 h，收集細胞并加入RIPA裂解液提取蛋白，在SDS-PAGE凝膠中進行電泳、電轉移至NC膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后加入1 ∶1 000稀釋的p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3一抗或1 ∶5 000稀釋的β-actin一抗，4 ℃孵育過夜。次日，加入辣根過氧化物酶標記的二抗并在室溫孵育1 h，洗膜后加入顯影液、在化學顯影儀中曝光得到蛋白條帶，用ImageJ軟件掃描條帶灰度值，以β-actin為內參、計算蛋白表達水平。

1.2.7統計學方法 數據以均數±標準差表示，采用SPSS20.0軟件對組間數據進行方差分析。

2 結果

2.1 IL-12對YTS細胞活力、細胞周期及細胞凋亡的影響為了研究IL-12的抗NK/T細胞淋巴瘤活性，本實驗培養了YTS細胞并用不同濃度的IL-12進行干預。如Fig 1A所示，與對照組比較，0.625 μg·L-1、1.25 μg·L-1IL-12干預后的細胞活力OD570值無顯著變化(P>0.05)，2.5 μg·L-1、5.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1、20.0 μg·L-1IL-12干預后的細胞活力OD570值顯著減低(P<0.05)，說明2.5 μg·L-1、5.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1、20.0 μg·L-1的IL-12能夠抑制YTS細胞的生長，后續選用2.5 μg·L-1、5.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1、20.0 μg·L-1的IL-12繼續進行實驗。

細胞周期和細胞凋亡是與細胞生長活力密切相關的生物學環節，YTS細胞的細胞周期及細胞凋亡檢測如Fig 1B和1C所示：2.5 μg·L-1、5.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1、20.0 μg·L-1IL-12干預后，YTS細胞中G0/G1期比例以及凋亡率均顯著升高(P<0.05)、S期比例顯著降低(P<0.05)、G2/M期比例無顯著變化(P>0.05)，說明IL-12能夠使YTS細胞的細胞周期停滯、促進YTS細胞的凋亡。

2.2 IL-12對YTS細胞中JAK2/STAT3通路的影響JAK2/STAT3通路是調節細胞活力、細胞周期、細胞凋亡的重要信號通路，為了明確IL-12發揮生物學效應的機制，本實驗在不同濃度IL-12干預后、通過Western blot檢測了p-JAK2、p-STAT3的表達，結果如Fig 2所示，2.5 μg·L-1、5.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1、20.0 μg·L-1IL-12干預后，YTS細胞中p-JAK2、p-STAT3的表達量顯著降低(P<0.05)，說明IL-12能夠抑制YTS細胞中JAK2/STAT3通路的激活。

A: IL-12 inhibited the viability of YTS cells(1:Control group; 2: 0.625 μg·L-1IL-12; 3: 1.25 μg·L-1IL-12; 4: 2.5 μg·L-1IL-12; 5: 5.0 μg·L-1IL-12; 6: 10.0 μg·L-1IL-12; 7: 20.0 μg·L-1IL-12); B: IL-12 inhibited the cell cycle of YTS cells(1:Control group; 2: 5.0 μg·L-1IL-12; 3: 10.0 μg·L-1IL-12; 4: 20.0 μg·L-1IL-12); C: IL-12 induced the apoptosis of YTS cells.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

2.3 轉染JAK2 siRNA對YTS細胞活力、細胞周期及細胞凋亡的影響IL-12能夠抑制YTS細胞中JAK2/STAT3通路的激活，為了驗證JAK2/STAT3通路受抑制后是否影響YTS細胞的細胞活力、細胞周期及細胞凋亡，本使用通過轉染JAK2 siRNA的方式來抑制JAK2的表達，結果如Fig 3A及3B所示，轉染JAK2 siRNA后YTS細胞中JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3。

在轉染JAK2 siRNA、抑制JAK2及STAT3的表達后，本實驗檢測了細胞活力、細胞周期及細胞凋亡，結果如Fig 3C、3D所示，與對照組及NC siRNA組比較，JAK2 siRNA組的細胞活力OD570值、S期比例顯著減低(P<0.05)，G0/G1期比例、凋亡率均顯著升高(P<0.05)，G2/M期比例無顯著變化(P>0.05)，說明抑制JAK2的表達能夠使YTS細胞的細胞活力降低、細胞周期停滯、細胞凋亡增強。

2.4 轉染JAK2表達質粒對IL-12調節YTS細胞活力、細胞周期及細胞凋亡的影響為了驗證JAK2/STAT3通路在IL-12調節YTS細胞活力、細胞周期及細胞凋亡中的作用，本實驗在用20.0 μg·L-1IL-12干預的同時轉染了JAK2表達質粒。與空白質粒組比較，20.0 μg·L-1IL-12+空白質粒組的p-JAK2、p-STAT3表達量及細胞活力OD570值、S期比例顯著減低(P<0.05)，G0/G1期比例、凋亡率均顯著升高(P<0.05)，G2/M期比例無顯著變化(P>0.05)；與20.0 μg·L-1IL-12+空白質粒組比較，20.0 μg·L-1IL-12+JAK2表達質粒組的p-JAK2、p-STAT3表達量及細胞活力OD570值、S期比例、G2/M期比例顯著增加(P<0.05)，G0/G1期比例、凋亡率均顯著降低(P<0.05)。說明IL-12對YTS細胞活力、細胞周期及細胞凋亡調節作用部分由JAK2/STAT3通路介導。見Fig 4。

Fig 2 Effect of IL-12 on f p-JAK2, p-STAT3 expression in YTS

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

Fig 3 Effect of JAK2 siRNA on viability, cell cycle, apoptosis of YTS

A: Transfection of JAK2 siRNA inhibited the expression of JAK2 and STAT3 in YTS cells; B: Transfection of JAK2 siRNA inhibited the viability of YTS cells; C: Transfection of JAK2 siRNA inhibited the cell cycle of YTS cells; D: Transfection of JAK2 siRNA induced the apoptosis of YTS cells.**P<0.01vscontrol group.##P<0.01vsNC siRNA group

2.5 IL-12對YTS細胞移植瘤生長及JAK2/STAT3通路的影響經細胞實驗明確IL-12通過JAK2/STAT3通路調節YTS細胞的細胞活力、細胞周期及細胞凋亡后，本實驗通過YTS細胞移植瘤驗證了IL-12的抗NK/T細胞淋巴瘤活性。在建立YTS細胞移植瘤小鼠模型后給予IL-12干預，移植瘤質量明顯減輕(P<0.05，Fig 5A)，移植瘤中p-JAK2、p-STAT3的表達明顯減少(P<0.05，Fig 5B)。

Fig 4 Effect of JAK2 expressed plasmid on IL-12 regulating viability, cell cycle, apoptosis of YTS

A: Transfection of JAK2 expressed plasmid attenuated the effect of IL-12 on p-JAK2, p-STAT3 expression in YTS cells; B: Transfection of JAK2 expressed plasmid attenuated the effect of IL-12 on viability of YTS cells; C: Transfection of JAK2 expressed plasmid attenuated the effect of IL-12 on cell cycle of YTS cells; D: Transfection of JAK2 expressed plasmid attenuated the effect of IL-12 on apoptosis of YTS cells.**P<0.01vsblank plasmid group,##P<0.01vs20 μg·L-1IL-12+blank plasmid group.

Fig 5 Effect of IL-12 on weight and JAK2/STAT3 of xenotransplanted

A: IL-12 decreased the weight of xenotransplanted tumor. B: IL-12 inhibited the expression of p-JAK2, p-STAT3 in xenotransplanted tumor.**P<0.01vscontrol group

3 討論

NK/T細胞淋巴瘤是我國常見的非霍奇金淋巴瘤類型，近年來的發病率呈升高趨勢且對傳統CHOP化療方案不敏感，臨床治療效果不佳、預后差[10-11]。近年來，免疫活性細胞因子在惡性腫瘤治療中的作用受到了越來越多的關注，包括IL-12在內的多種細胞因子不僅能夠通過免疫調節作用來增強機體的抗腫瘤免疫應答、發揮抗腫瘤作用，還能直接作用于腫瘤細胞并影響凋亡、增殖、遷移、侵襲等惡性生物學行為，進而發揮抗腫瘤作用。在本實驗中，IL-12被用于NK-T細胞淋巴瘤細胞株YTS的干預，0.625、1.25的IL-12干預后，YTS細胞的活力無顯著變化；2.5、5.0、10.0、20.0 μg·L-1的IL-12干預后，YTS細胞的活力明顯降低且隨著IL-12濃度的增加，細胞活力的下降更加明顯，說明IL-12能夠在一定范圍內以濃度依賴性的方式降低YTS細胞的細胞活力、具有抗NK-T細胞淋巴瘤的作用。

為了明確IL-12影響NK-T細胞淋巴瘤細胞活力的可能機制，本實驗進一步對IL-12干預后的細胞周期、細胞凋亡等生物學行為進行了分析。細胞周期失控會使細胞大量進入有絲分裂階段、細胞凋亡受阻則會影響異常分裂細胞的清除，最終引起細胞過度增殖、表現為細胞活力增加；本實驗的分析顯示，5.0、10.0、20.0 μg·L-1的IL-12干預能夠誘導YTS細胞發生凋亡并使細胞周期大量停滯于G0/G1期且IL-12濃度越大，誘導凋亡及細胞周期停滯的效應越顯著，說明誘導細胞周期停滯、細胞凋亡是IL-12發揮抗NK-T細胞淋巴瘤作用的可能機制。

JAK2/STAT3通路是參與細胞凋亡、細胞周期調控的信號通路，生長因子是該信號通路重要的上游激活分子，刺激JAK2發生磷酸化后p-JAK2能夠引起STAT3發生磷酸化，p-STAT3能夠形成二聚體并進入細胞核，進而調節c-myc、CyclinD1、Bcl-2等基因的表達并起到加速細胞周期、抑制細胞凋亡、促進細胞遷移和侵襲[12]。已有研究報道，淋巴瘤組織中JAK2/STAT3通路呈過度活化的狀態，p-JAK2及p-STAT3均呈顯著高表達的狀態[13-14]；而使用JAK2/STAT3通路抑制劑AG490處理淋巴瘤細胞后，細胞周期及細胞遷移、侵襲均受到抑制，細胞凋亡則明顯增強[15]。本實驗在IL-12處理YTS細胞后觀察到：IL-12能夠以濃度依賴性的方式降低細胞中p-JAK2、p-STAT3的表達，說明IL-12對YTS細胞中JAK2/STAT3通路的活化具有抑制作用。

在此基礎上，為了明確IL-12的抗NK-T細胞淋巴瘤作用是否與抑制JAK2/STAT3通路的激活有關，本實驗首先通過轉染JAK2 siRNA的方式抑制JAK2的表達，在轉染JAK2 siRNA后，細胞中p-JAK2、p-STAT3的表達均減少，說明轉染JAK2 siRNA能夠抑制JAK2/STAT3通路的激活；在抑制JAK2/STAT3通路的激活后，細胞活力、細胞周期均受到抑制，而細胞凋亡明顯增強，說明JAK2/STAT3直接參與YTS細胞的細胞活力、細胞周期、細胞凋亡的調控。而后，通過轉染JAK2表達質粒的方式增加JAK2的表達，在20 μg·L-1IL-12干預的同時轉染JAK2表達質粒能夠使IL-12減少p-JAK2、p-STAT3表達的作用發生逆轉，同時也能使IL-12調節細胞活力、細胞周期、細胞凋亡的作用也發生逆轉。由此證實IL-12的抗NK-T細胞淋巴瘤作用與抑制JAK2/STAT3通路有關。

最后，本實驗還通過移植瘤動物實驗來驗證IL-12的NK-T細胞淋巴瘤作用，通過皮下注射YTS細胞的方式建立移植瘤小鼠模型，給予IL-12干預后觀察到移植瘤的質量及移植瘤中p-JAK2、p-STAT3的表達均明顯下降，這與IL-12在細胞實驗中通過JAK2/STAT3通路抑制細胞活力、細胞周期及誘導細胞凋亡的作用吻合，進一步證實IL-12具有抗NK-T細胞淋巴瘤作用且該作用與抑制JAK2/STAT3通路有關。

綜上所述，本實驗報道了IL-12的抗NK-T細胞淋巴瘤的作用，IL-12能夠以劑量依賴性的方式降低細胞活力、誘導細胞周期阻滯及細胞凋亡，抑制JAK2/STAT3可能是IL-12發揮抗NK-T細胞淋巴瘤的分子機制，未來IL-12有望成為治療抗NK-T細胞淋巴瘤的新藥物。