裂果薯皂苷單體Ⅰ通過TGF-β1調控上皮間質轉化對人肝癌細胞SMMC-7721侵襲和轉移的影響

呂美嫻，廖智紅，周 歡，周金玲，甘日植，朱洪卿，章璇璇，梁 鋼

(1. 廣西醫科大學藥學院，廣西 南寧 530021；2. 崇左市人民醫院，藥學部，廣西 崇左 532200)

肝癌是一種高致死率的惡性腫瘤，有易耐藥、易轉移的特點。肝癌的遠處轉移也是術后復發致死的主要原因。因此，抑制肝癌細胞侵襲和轉移是治療肝癌的關鍵問題。

肝癌細胞的侵襲與轉移是一個多步驟、多因素相互作用的復雜過程[1，2]。肝癌細胞從原發部位浸潤，破壞周圍正常組織，進入血液循環完成侵襲過程，然后隨著血液遷移到其他組織器官，進一步發展成繼發性癌灶是肝癌細胞的轉移過程。因此，抑制肝癌細胞的侵襲和轉移是貫穿腫瘤惡性發展的重要步驟，同時也成為了抗肝癌轉移的關鍵。

轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是一種具有多種生物學活性的生物因子,參與細胞的增殖、侵襲等過程[3，4]。Smad家族蛋白是TGF-β1/Smad信號通路的底物蛋白，是將 TGF-β1信號從細胞外轉導到細胞核內的重要蛋白因子。SIS3作為Smad蛋白抑制劑，通過抑制TGF-β1/ Smad信號通路的下游蛋白，從而阻斷TGF-β1/ Smad信號通路活性。馬艷等[5]報道，TGF-β1可誘導腫瘤細胞發生上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。EMT指上皮細胞和周圍間質互相作用過程中獲得的某些間質細胞特有表型的現象,目前被認為是癌細胞發生侵襲和轉移的關鍵啟動步驟[6]，能夠使細胞的侵襲及遷移能力增強。因而，抑制癌細胞發生EMT，有利于控制肝癌細胞侵襲和轉移。

目前，尋找新型抗人肝癌細胞侵襲轉移的藥物或天然活性物已成為提高肝癌治療水平和改善其預后是研究的熱點。中藥裂果薯是一種廣西特色的中草藥，屬壯、瑤藥，其拉丁名為：SchizocapsaplantagineaHance。裂果薯皂苷單體I(Saponin monomer I ofSchizocapsaplantagineaHance，SSPH Ⅰ)是從該植物中提取分離得到的甾體皂苷單體之一[7]。本項目組前期通過活性追蹤，發現SSPH Ⅰ對人肝癌細胞SMMC-7721的增殖、遷移有明顯的抑制作用[8，9]，但是其抗肝癌細胞侵襲遷移是否與TGF-β1/Smad通路有關尚未見相關報道。為此，本文將通過體外人肝癌細胞培養實驗，探討SSPH Ⅰ能否通過TGF-β1/Smad調控EMT發揮抗人肝癌細胞侵襲轉移的作用。旨在解決目前抗肝癌細胞侵襲、轉移情況的難點問題，同時為SSPH Ⅰ作為抗肝癌新藥研發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物裂果薯塊莖購自廣西壯族自治區資源縣瓜里鄉，并由廣西壯族自治區中醫藥研究院黃云峰教授鑒定為SchizocapsaplantagineaHance,裂果薯皂苷單體I(Saponin monomer I ofSchizocapsaplantagineaHance，SSPH Ⅰ)由本課題組提取與鑒定。取0.97 mg的SSPH Ⅰ粉末，加入970 μL的DMSO，制成970 μmol·L-1母液，4 ℃保存備用，正式實驗中用細胞培養液稀釋成相應濃度備用。

1.2 細胞系SMMC-7721人肝癌細胞株購自中國科學院上海細胞庫并由本課題組傳代培養。

1.3 實驗分組實驗以10 μg·L-1的TGF-β1誘導SMMC-7721細胞發生EMT，以10 μmol·L-1的SIS3阻斷TGF-β1/Smad信號通路，以此作為陰性對照。實驗分為6組：空白對照組、TGF-β1對照組、TGF-β1聯合SIS3組、TGF-β1聯合不同濃度的SSPH Ⅰ給藥組。

1.4 試劑胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，貨號：11011-8611)；0.25%胰酶消化液、青-鏈霉素混合液、磷酸鹽(PBS)緩沖液、MTT、二甲基亞砜(DMSO)(北京索萊寶科技有限公司，貨號T1300-100；P1400-100；P1020-500；M8180；D8370)；DMEM高糖培養基(HyClone 公司，貨號：C11995500BT)；BCA 蛋白濃度測定試劑盒 ( 碧云天生物科技有限公司,貨號：P0010S) ；GAPDH抗體,重組人轉化生長因子TGF-β1,Smad7抗體(武漢三鷹生物技術有限公司，貨號：10494-1-AP；10804-HNAC；25840-1-AP)；E-cadherin，N-cadherin,Vimentin，Smad2/3，p-Smad2/3抗體，HRP 標記的山羊抗兔IgG(美國CST公司，貨號：3195T、13116T、5741T、5678S、8828S、5151P)。

1.5 儀器酶聯免疫檢測儀，二氧化碳孵箱( 美國Thermo Fisher scientific 公司) ; 超凈工作臺( 蘇州安泰空氣技術有限公司) ; 熒光倒置顯微鏡(日本OLYMPUS 公司); 電泳儀及轉膜儀 (北京六一生物科技有限公司) 。

1.6 實驗方法

1.6.1MTT法檢測SSPH Ⅰ對細胞增殖的影響 將SMMC-7721細胞用0.25%胰酶消化，調整細胞濃度為1×106個·mL-1，接種于96孔板中，每孔100 μL，每組設6個復孔，共10組。培養箱中孵育至細胞貼壁生長至80%時，棄去培養基，加入不同濃度的SSPH Ⅰ(0.06、0.12、0.24、0.49、0.97、1.94、3.88、7.76、15.52 μmol·L-1)，每孔100μL，孵育24 h后，每孔加入0.5 g·L-1的MTT溶液各100 μL孵育4 h，棄去MTT溶液，每孔加入100 μL DMSO，搖床上振搖15 min，在490 nm波長下測其OD值。細胞抑制率/%=(空白組平均值-給藥組平均值)/空白組平均值×100%。以細胞增殖抑制率與給藥濃度作圖，求出IC50。

1.6.2劃痕實驗檢測SSPH Ⅰ對細胞遷移能力的影響 制備單細胞懸液(1×106·mL-1)，每孔100 μL接種于96孔板中，每組設置4個復孔。待細胞長至80%后，用10 μg·L-1的TGF-β1刺激細胞24 h。200 μL的槍頭于正中央劃痕，每孔一道，PBS洗3遍，輕輕吹打下散落的細胞。以給完藥時刻作為0 h，設置拍照時間為0、24、48 h，固定同一個視野進行拍照。利用Image J軟件統計各組劃痕寬度。24 h細胞遷移率/%=|(24 h劃痕寬度-0 h劃痕寬度)|/0 h劃痕寬度×100%，48 h細胞遷移率/%=|(48 h劃痕寬度-0 h劃痕寬度)|/0 h劃痕寬度×100%。

1.6.3Transwell小室侵襲實驗檢測SSPH Ⅰ對細胞侵襲能力的影響 Matrigel基質膠與無血清的培養基1 ∶4混合稀釋，每孔50 μL加入小室內，培養箱中溫育1 h至基質膠凝固。將SMMC-7721單細胞懸液(1×107·mL-1)以每孔100 μL接種于小室上室中，每孔100 μL的SSPH Ⅰ藥液與細胞懸液混合置于上室。下室加入800 μL含20%血清的培養基，孵育24 h，棄去培養基，PBS洗2遍，小室放入冰甲醇中固定30 min，PBS洗2～3遍，待膜完全風干后放入有800 μL 0.1%的結晶紫溶液中，染色30 min。PBS洗2～3遍，風干，然后取4個視野，20×顯微鏡下拍照，觀察SSPH Ⅰ對細胞侵襲能力影響的情況。

1.6.4Western blot實驗 以RIPA ∶PMSF ∶磷酸化抑制劑=100 ∶1 ∶1的比例配制蛋白裂解液，每孔100 μL收集細胞，冰上裂解15 min后13 000 r·min-1離心20 min,收集上清液。用BCA試劑盒測定蛋白濃度，加蛋白上樣緩沖液制樣，100 ℃沸水中加熱5 min使蛋白變性。按照每個泳道100 μg的蛋白量進行電泳，轉膜。TBST洗膜3次，每次5 min。Smad7、Smad2/3、p-Smad2/3、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin一抗于4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次5 min。室溫下二抗孵育1 h。最后用近紅外雙色成像系統進行定量分析。

2 結果

2.1 SSPH Ⅰ抑制SMMC-7721細胞增殖MTT實驗結果表明，SSPH Ⅰ抑制SMMC-7721細胞增殖(Fig 1)。在24 h的IC50為1.72 μmol·L-1，可見SSPH Ⅰ對SMMC-7721細胞增殖有明顯抑制作用(P<0.01)。為了更好的觀察SSPH Ⅰ對SMMC-7721細胞侵襲轉移的影響，選擇0.73、1.46、2.92 μmol·L-1這3個濃度進行實驗研究。

2.2 SSPH Ⅰ抑制SMMC-7721細胞遷移細胞劃痕實驗顯示(Fig 2A)，隨著SSPH Ⅰ濃度的增加，TGF-β1+SSPH Ⅰ組細胞遷移率降低。Control組、TGF-β1組、TGF-β1+SIS3組、TGF-β1+SSPH Ⅰ(0.73、1.46、2.92 μmol·L-1)組24 h細胞遷移率分別為(19.09±3.72)%、(27.1±4.84)%、(8.32±1.6)%、(6.89±3.29)%、(6.09±2.28)%、(5.01±2.98)%。48小時細胞遷移率分別為(30.48±8.94)%、(44.74±10.02)%、(5.51±2.91)%、(9.05±5.24)%、 (8.35±1.73)%、(11.86±3.95)%。與Control組相比，24 h和48 h的TGF-β 1組細胞遷移率明顯升高(P<0.05)，說明TGF-β1促進細胞遷移。與TGF-β1組相比(Fig 2B,C)，TGF-β1+SSPH Ⅰ組24 h和48 h的細胞遷移率明顯降低(P<0.01)。與TGF-β1+SIS3組結果相同。

2.3 SSPH Ⅰ抑制SMMC-7721細胞侵襲Transwell實驗結果顯示(Fig 3A)，SSPH Ⅰ明顯抑制SMMC-7721細胞的侵襲和轉移。Control組、TGF-β1組、TGF-β1+SIS3組、TGF-β1+SSPH Ⅰ(0.73、1.46、2.92 μmol·L-1)組的細胞侵襲數分別是219±55、277±48、94±30、116±39、83±40、23±14個(Fig 3B)。與Control組相比，TGF-β1組穿過基質膠與濾膜侵襲入下室的SMMC-7721細胞數明顯增多(P<0.05)。與TGF-β1組相比，TGF-β1+SSPH Ⅰ組的侵襲細胞數明顯減少(P<0.01)。與TGF-β1+SIS3組結果相同。

Fig 1 Effect of SSPH Ⅰ on proliferation of

**P<0.01vscontrol

Fig 2 Effect of SSPH Ⅰ on migration of SMMC-7721

A： The result of cell scratch assay；B： The cell migration rate of 24 h；C.The cell migration rate of 48 h；1：Control；2：TGF-β1；3：TGF-β1+SIS3；4：TGF-β1+SSPH Ⅰ 0.73 μmol·L-1；5：TGF-β1+SSPH Ⅰ 1.46 μmol·L-1；6：TGF-β1+SSPH Ⅰ 2.92 μmol·L-1(ΔP<0.05vscontrol,**P<0.01vsTGF-β1)

Fig 3 Effect of SSPH Ⅰ on invasion of

A：The result of Transwell assay； B：The number of cell invasion;1：Control；2：TGF-β1；3：TGF-β1+SIS3；4：TGF-β1+SSPH Ⅰ 0.73 μmol·L-1；5：TGF-β1+SSPH Ⅰ 1.46 μmol·L-1；6：TGF-β1+SSPH Ⅰ 2.92 μmol·L-1.(△P<0.05vscontrol,**P<0.01vsTGF-β1)

2.4 SSPH Ⅰ抑制TGF-β1/Smad信號通路和EMTWestern blot結果顯示，與Control組相比較，TGF-β1組E-cadherin蛋白表達降低，N-cadherin和Vimentin蛋白表達升高(P<0.05)。說明TGF-β1誘導SMMC-7721細胞發生EMT(Fig5A)。同時，TGF-β1組p-Smad2/3蛋白表達增加(P<0.05)，Smad7蛋白表達降低(P<0.01)。可見TGF-β1通過激活TGF-β1/Smad信號通路而發揮作用(Fig 4A)。與TGF-β1組相比，TGF-β1+SSPH Ⅰ組N-cadherin和Vimentin蛋白表達降低(Fig 5B)，E-cadherin蛋白表達增加(Fig 5B)，此外p-Smad2/3蛋白表達降低(Fig 4B)，Smad7蛋白表達增加(Fig 4B)。結果與TGF-β1+SIS3組相同(P均<0.05)。說明SSPH Ⅰ通過阻斷TGF-β1/Smad信號通路，抑制EMT的發生。

Fig 4 Effect of SSPH Ⅰ on TGF-β1/Smad signaling

A. The effect of SSPH Ⅰ on key proteins of TGF-β1/Smad signaling pathway；B.The result of relative protein expressionof TGF-β1/Smad signaling pathway;1：Control；2：TGF-β1；3：TGF-β1+SIS3；4：TGF-β1+SSPH Ⅰ 0.73 μmol·L-1；5：TGF-β1+SSPH Ⅰ 1.46 μmol·L-1；6：TGF-β1+SSPH Ⅰ 2.92 μmol·L-1.(△P<0.05,△△P<0.01vscontrol,**P<0.01vsTGF-β1)

3 討論

原發性肝癌主要以肝細胞癌( hepatocellular carcinoma，HCC) 為主，是一種常見的高致死率的惡性腫瘤。肝癌細胞的侵襲和轉移是其一個重要的生物學特性。也是術后復發致死的主要原因。細胞劃痕實驗和Transwell小室侵襲實驗是反映腫瘤細胞侵襲和轉移的重要指標。根據實驗結果，TGF-β1組的細胞遷移率和侵襲數量較Control組明顯增加，但這一作用被SSPH Ⅰ明顯抑制，可見，SSPH Ⅰ能抑制SMMC-7721細胞侵襲轉移,其機制可能與抑制TGF-β1的生物學作用有關。

Fig 5 Effect of SSPH Ⅰ on EMT SMMC-7721

A. The effect of SSPH Ⅰ on EMT；B.The result of relative protein expression of EMT;1：Control；2：TGF-β1；3：TGF-β1+SIS3；4：TGF-β1+SSPH Ⅰ 0.73 μmol·L-1；5：TGF-β1+SSPH Ⅰ 1.46 μmol·L-1；6：TGF-β1+SSPH Ⅰ 2.92 μmol·L-1.(△P<0.05,△△P<0.01vscontrol,**P<0.01vsTGF-β1)

EMT是癌細胞惡性轉化的重要因素，是很多腫瘤細胞侵襲和轉移的開始[10-12]，能促進癌細胞侵入其他器官，誘導轉移瘤的發生。研究發現，TGF-β1能夠誘導肝癌細胞發生EMT，使細胞喪失連接和極性，導致侵入性遷移間充質細胞的形成，同時伴隨著細胞粘附的破壞，最終導致癌細胞轉移侵入至其他正常組織。EMT的主要表現是E-cadherin表達降低，同時N-cadherin和 Vimentin表達增加。根據Western blot結果，與Control組相比，TGF-β1組細胞的E-cadherin、N-cadherin和 Vimentin蛋白表達符合上述情況，說明TGF-β1能促進細胞發生EMT效應，增強肝癌細胞侵襲轉移能力。隨著SSPH Ⅰ給藥濃度的增加，上述蛋白效應被逆轉。

TGF-β1/Smad信號通路是經典的信號傳導通路[13-14]。其中TGF-β1是誘導EMT的重要生物因子。TGF-β1誘導激活TGF-β1/Smad信號通路，促進TGF-β配體結合II型受體二聚體，引起胞內 Smad2 和Smad3 的磷酸化，與Smad4形成復合物進入細胞核，調節相應靶基因轉錄與表達，例如，上調N-cadherin和Vimentin蛋白的表達，下調E-cadherin蛋白的表達，而這一結果最終誘導腫瘤細胞發生EMT，使癌細胞遷移和侵襲能力增強[15]。但是，TGF-β1/Smad信號通路是否在SSPH Ⅰ抑制SMMC-7721侵襲和轉移中發揮重要作用，值得我們進一步驗證。通過Western blot實驗我們發現，TGF-β1能誘導SMMC-7721細胞發生EMT，同時激活TGF-β1/Smad信號通路，使得p-Smads2/3蛋白表達上調，同時負調控Smads7蛋白表達。但是SSPH Ⅰ給藥處理細胞后，上述分子效應被阻斷，肝癌細胞遷移率和侵襲數量降低。效應與TGF-β1/Smad信號通路抑制劑SIS3相同。除此之外，EMT標志性蛋白E-cadherin增加，N-cadherin和Vimentin蛋白降低。表明SSPH Ⅰ通過抑制TGF-β1/Smad阻斷癌細胞EMT效應，從而達到抑制癌細胞侵襲和轉移的效果。

綜上所述，SSPH Ⅰ具有拮抗肝癌細胞侵襲轉移的作用，其機制與介導TGF-β1/Smad信號通路，阻斷EMT有關。SSPH Ⅰ作為一種新型的抗腫瘤中藥，在抑制肝癌細胞侵襲轉移方面具有積極的意義，這也為SSPH Ⅰ通過靶向EMT治療肝癌細胞侵襲轉移提供一定的理論實驗基礎。