孕酮對Aβ所致星形膠質細胞炎癥小體表達的影響及機制研究

洪 洋，王明霞，夏龍飛，劉運江

(河北醫科大學第四醫院1.臨床藥理研究部、2. 檢驗科東、3. 乳腺中心，石家莊 050000)

阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease，AD)又稱老年癡呆，是以記憶和認知功能障礙為主要特征的中樞神經系統退行性病變[1]。最近研究發現，神經炎癥反應在AD病理學發展方面起到了關鍵的調節作用[2]。值得注意的是，在AD患者的大腦皮層和皮層下結構出現大量異常活化的星形膠質細胞。這些活化的星形膠質細胞聚集于AD患者腦內淀粉樣蛋白和神經纖維纏結周圍，并產生促炎癥調節因子。這已經構成了AD發病早期出現的重要病理學現象[3]。這就提示我們，調節星形膠質細胞功能可能成為治療大腦神經炎癥反應的重要靶點。

近期大量的研究證實，神經甾體孕酮(progesterone，PG)具有顯著的神經保護性作用，尤其在調節AD認知功能方面表現出獨特的作用[4,5]。研究組前期發現，在AD模型大鼠腦內PG分泌水平顯著降低，當給予PG體內干預后AD大鼠認知功能得到明顯改善[6]。然而，關于PG神經保護機制的探討尚未完全闡明，其中PG對于腦神經炎癥反應的調控機制尚不清楚，NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor proteins 3，NLRP3)炎癥小體所介導的神經炎癥反應分子機制還需要進一步探索。因此，本文旨在研究PG對于Aβ誘導星形膠質細胞異常活化的調節作用，探索誘導NLRP3炎癥小體活化可能分子機制，為PG改善AD早期大范圍神經炎癥反應提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器新生SD鼠，清潔級，河北省實驗動物中心提供[許可證號:SCXK(冀)2008-1003]；神經甾體PG、Aβ1-42片段，內質網應激抑制劑Salubrinal (Sal)，內質網應激促進劑Tunicamycin (TM)均購置美國Sigma公司(St. Louis,MO,USA)，DMEM培養液和胎牛血清FBS購置Gibco (Carlsbad,CA,USA)，NLRP3、pro-IL-1β、β-actin抗體購置Cell Signaling 公司 (Beverly,MA,USA)。羊抗兔/FITC多克隆抗體購置Bioss公司(Beijing,China)。

1.2 原代星形膠質細胞培養星形膠質細胞來源于新生SD大鼠大腦皮層，無菌條件下破碎組織，制備單細胞懸液，37 ℃，5% CO2條件下孵育培養，每2 d更換培養液，待細胞充分覆蓋后，37 ℃震蕩去除多余小膠質細胞，應用免疫熒光染色鑒定星形膠質細胞純度(純度>95%)，純化后的細胞分別接種于細胞培養板(用于ELISA、Immofluorescence、Western blot試驗)。

1.3 ELISA檢測取正常培養星形膠質細胞，經過干預處理后，應用ELISA試劑盒檢測細胞上清IL-1β的分泌水平改變。首先，建立0～1 000 ng·L-1標準曲線。然后取上清100 μL加入到預先孵育抗IL-1β培養板內。根據試劑盒說明書要求，分別要求依次加入檢測試劑。最后應用酶標儀在450 nm處檢測細胞上清IL-1β濃度。

1.4 Western blot檢測取星形膠質細胞裂解后提取總蛋白，BCA蛋白試劑盒計算蛋白含量，提取蛋白，分別制備10%或15% SDS分離膠分離蛋白，并通過半干轉法轉移至PVDF膜。PVDF膜應用5%脫脂奶粉封閉，4 ℃分別孵育pro-IL-1β和NLRP3抗體過夜，室溫孵育二抗2 h，ECL光化學顯色。最后應用Image J分析軟件對掃描條帶進行定量分析。

1.5 免疫熒光檢測取4%甲醛固定星形膠質細胞，0.05% Triton X-100和3% BSA封閉打孔，4 ℃分別孵育NLRP3抗體過夜，室溫孵育二抗2 h，DAPI進行核染色，應用熒光顯微鏡檢測細胞。

1.6 藥物干預與分組取正常培養星形膠質細胞，隨機分為對照組、Aβ組(5 μmol·L-1)、TM組(5 μmol·L-1)、PG保護組(1 μmol·L-1)、Sal處理組(10 μmol·L-1)。Aβ組給予多聚化Aβ1-42干預6 h；TM處理組應用TM干預處理2 h；PG保護組給予PG和TM或Aβ共同處理6 h；Sal處理組應用Sal預處理1 h，然后與PG、Aβ共處理6 h。對照組給予DMEM培養基對照處理。

2 結果

2.1 PG抑制Aβ誘導星形膠質細胞NLRP3表達活化如Fig 1免疫熒光結果所示，與對照組相比較，Aβ干預處理6 h，在星形膠質細胞內炎癥小體NLRP3出現了大量聚集，在胞質和胞核附近均出現明顯表達；相比Aβ組，PG明顯抑制了Aβ所致星形膠質細胞NLRP3的大量表達。

Fig 1 Aβ-induced NLRP3 inflammasome activation

Left picture was control group,middle picture was Aβ-treated group,right picture was PG-treated group; NLRP3 was stained green,nucleus was stained blue,scale bar=20 μm

2.2 PG通過調節內質網應激抑制Aβ誘導星形膠質細胞IL-1β分泌如Fig 2 ELISA結果所示，相比對照組，Aβ組和TM組IL-1β分泌水平均出現明顯增加(P<0.01)；相比Aβ組和TM組，PG明顯抑制IL-1β分泌水平增加(P<0.01)。

Fig 2 Aβ-induced IL-1β secretion via regulating ER stress

**P<0.01vsAβ-treated group,##P<0.01vsTM-treated group

2.3 PG通過調節內質網應激抑制Aβ誘導星形膠質細胞pro-IL-1β表達如Fig 3 Western blot結果所示，相比對照組，Aβ和TM均促進了星形膠質細胞pro-IL-1β表達(P<0.05)。相比Aβ組和TM組，PG明顯抑制Aβ或TM所致pro-IL-1β表達水平增加(P<0.05)。研究結果表明，PG能通過抑制內質網應激活化降低星形膠質細胞成熟型pro-IL-1β片段的形成。

Fig 3 Aβ-induced pro-IL-1β expression via regulating ER

*P<0.05 vs Aβ-treated group,#P<0.05vsTM-treated group

2.4 PG通過調節內質網應激抑制Aβ所致星形膠質細胞NLRP3表達活化如Fig 4 Western blot結果所示，相比對照組，Aβ組明顯促進星形膠質細胞NLRP3表達活化(P<0.05)。相比Aβ組，PG明顯抑制NLRP3表達水平的增加(P<0.05)。相比于PG保護組，Sal明顯性阻斷PG對于 Aβ所誘導NLRP3表達的抑制作用(P<0.05)。研究結果說明，PG通過調節內質網應激活化抑制Aβ所致星形膠質細胞NLRP3表達增加。

Fig 4 Aβ-induced NLRP3 expression via regulating ER

*P<0.05vsAβ-treated group,#P<0.05vsPG-treated group

3 討論

隨著AD致病機制的深入研究，神經炎癥反應作為AD重要的病理學特征之一逐漸受到研究者的廣泛關注[7]。研究發現，AD患者的大腦皮層和皮層下結構存在廣泛的膠質細胞活化，且伴隨著大范圍炎癥反應發生。這已經構成AD早期出現的重要病理學改變。因此，減少Aβ所引起的星形膠質細胞功能損傷可能成為降低其所誘發的大范圍神經炎癥反應的重要防治策略之一。IL-1β常常被看作是一個“疾病因子”，對腦海馬依賴的記憶功能表現出持續的影響[8]。然而，IL-1β的成熟和分泌需要NLRP3炎癥小體活化的參與。研究顯示，NLRP3炎癥小體活化以及其所介導的促炎癥反應信號通路對于調節AD損傷方面表現出明顯作用[9]。我們研究發現，Aβ能夠誘導NLRP3炎癥小體在星形膠質細胞內大量活化表達。因此，為了解決AD治療的重要問題，亟待開發抑制NLRP3炎癥小體表達活化有效藥物并闡明可能的調控機制。

神經甾體PG作為重要的內源性神經活性甾體化合物，在調節神經細胞功能方面發揮著重要作用，特別是對改善AD方面發揮著潛在的治療功能[6]。但是，PG對于AD的神經保護機制尚未完全闡明。目前大量研究發現，PG在調節腦缺血和腦損傷方面表現出顯著的神經保護性作用，特別是在促進神經元存活，抑制神經元凋亡等方面作用明顯[5,10]。然而，關于PG對于神經炎癥反應的調節作用研究較少。我們首先評估神經甾體PG對于NLRP3炎癥小體表達的影響，研究發現，PG能夠顯著性的抑制Aβ所致的星形膠質細胞NLRP3表達，并降低Aβ所誘導的神經炎癥反應IL-1β、pro-IL-1β的合成分泌。盡管PG對于NLRP3炎癥小體在細胞分子內的調控機制尚未完全闡明，但是可以肯定的是，在溶酶體損傷[11]、線粒體鈣離子通量改變[12]，以及氧化應激片段ROS形成[13]等應激條件下能明顯激活細胞內NLRP3炎癥信號。為了證實上述假設，我們應用內質網應激誘導劑TM或Aβ干預星形膠質細胞，然后給予PG處理后發現，PG能夠明顯抑制TM或Aβ所致IL-1β、pro-IL-1β分泌以及NLRP3的表達合成。與之相反，內質網應激抑制劑Sal顯著阻斷了PG對于Aβ所致NLRP3表達的抑制作用。在一定程度說明了PG對于AD的神經保護性作用，特別是對于NLRP3相關神經炎癥反應的抑制作用，并在調控內質網應激相關AD功能損傷方面存在潛在的聯系[14]。該研究結果表明， NLRP3炎癥小體可能成為神經甾體PG對于AD治療的一個潛在的分子調控靶點。

綜上所述，本研究闡明了神經甾體PG對于Aβ所致星形膠質細胞NLRP3炎癥小體活化的神經保護性機制，并建立了Aβ所致內質網應激活化與星形膠質細胞神經炎癥反應的潛在聯系，進一步加深我們對于AD致病機制的認識，為AD的臨床治療提供新的治療思路。