紫花地丁止癢復(fù)方對RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒的影響

張 蝶，王 瑋，賈婷婷，袁 夏，高雅茹，袁 易，曾海榮

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200062)

過敏性皮炎是機體與環(huán)境中過敏原接觸引起免疫系統(tǒng)失調(diào)而導(dǎo)致的過敏性皮膚病[1-2]，是一個慢性、易復(fù)發(fā)的炎癥性皮膚疾病。過敏性皮炎的發(fā)生是由一系列過敏原致敏、肥大細(xì)胞激活、免疫細(xì)胞應(yīng)答的復(fù)雜過程[3]。肥大細(xì)胞是過敏反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞，通常存在于抗原介導(dǎo)的過敏反應(yīng)中，在過敏性皮膚病以及炎癥過程中發(fā)揮重要作用[4]。B細(xì)胞產(chǎn)生的特異性IgE抗原，與肥大細(xì)胞表面高親和力的IgE抗體結(jié)合，導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流，引起肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放生物活性物質(zhì)，滲透到組織間引起皮炎癥狀的發(fā)生[5]。本研究以類肥大細(xì)胞RBL-2H3為研究對象，考察紫花地丁止癢復(fù)方(Violayedoensismakino antiitching compound, VYAC)對過敏性皮炎中肥大細(xì)胞脫顆粒的影響及機制。

1 材料

1.1 細(xì)胞株與試劑大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞株RBL-2H3，購于中科院細(xì)胞庫。紫花地丁(批號：141118-201411)、苦參(批號：141006-201410)、白鮮皮(批號：140821-201408)，購于上海康橋中藥飲片有限公司，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實驗中心高級實驗員李俊松鑒定合格，其拉丁名分別為紫花地丁(ViolayedoensisMakino)、苦參(SophoraflavescensAiton)、白鮮皮(DictamnusdasycarpusTurcz)；DMEM購于美國Gibco公司；胎牛血清(FBS)購于美國HyClone公司；牛血清白蛋白(BSA)、Fluo-3AM，購于北京Solaibo公司；Immobilon ECL發(fā)光液、BCA蛋白測定試劑盒，購于美國Thermo Scientific公司；抗體Syk、p-Syk、PI3K、Akt、p-Akt、β-acitn，均購于美國Cell Signaling Technology公司；CCK-8試劑盒，購于南京建成生物科技有限公司；C48/80、4-硝基苯基-N-乙酰-β-D-氨基半乳糖苷，購于美國Sigma公司；組胺ELISA試劑盒，購于德國Nordhorn公司；臺盼藍(lán)染液，購于美國Invitrogen公司。

1.2 儀器Delta series生物安全柜(美國Labconco公司)；HEPA CLASS100 CO2培養(yǎng)箱、多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；Countes II FL全自動細(xì)胞計數(shù)儀(美國Life Technologies公司)；倒置式生物顯微鏡TS100-F(日本尼康公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)；Centrifuge5810 R低溫高速離心機(德國Eppendorf公司)。

2 方法

2.1 VYAC提取物制備VYAC為上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院張偉榮教授的臨床驗方，經(jīng)臨床長期驗證其安全有效。該方具有清熱解毒、祛風(fēng)止癢等功效，主要用于濕疹、蕁麻疹和皮膚瘙癢等癥。主要由紫花地丁、苦參、白鮮皮組成。紫花地丁30 g、苦參15 g、白鮮皮15 g加10倍量水,浸泡30 min，減壓回流提取2次,每次1 h,合并濾液，濃縮，真空冷凍干燥待用，具體的提取工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參見已發(fā)表的文章[6-7]。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)RBL-2H3細(xì)胞用含有10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)進行傳代及后續(xù)實驗。

2.3 CCK-8檢測VYAC對RBL-2H3細(xì)胞存活率的影響取對數(shù)期生長期的RBL-2H3細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，DMEM完全培養(yǎng)基稀釋成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為8×107·L-1細(xì)胞懸液，100 μL每孔接種于96孔板，每組3個復(fù)孔，外圍一圈邊緣孔用等量無菌PBS填充。細(xì)胞過夜貼壁后，將孔內(nèi)的培養(yǎng)基換成100 μL含終濃度為6.25、12.5、25、50、100、200、400、800、1 000 mg·L-1的VYAC培養(yǎng)液，正常對照及空白組加入等量無藥培養(yǎng)液。培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，每孔加上10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，于酶標(biāo)儀450 nm波長測定吸光度，計算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率/%=(A加藥-A空白)/(A對照-A空白)×100%。

2.4 C48/80刺激RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒取對數(shù)生長期細(xì)胞，以2×108·L-1細(xì)胞懸液1 mL接種于24孔板，37 ℃培養(yǎng)箱過夜，1 mL PBS洗滌2次，加入200 μL終濃度為5、10、50、100、150、200、250、300 mg·L-1的C48/80培養(yǎng)液，同時設(shè)置不加C48/80的空白對照組，2個復(fù)孔。37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1 h，冰浴10 min終止反應(yīng)，檢查細(xì)胞脫顆粒情況。

2.4.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析 終止反應(yīng)后，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，并拍照分析。

2.4.2臺盼藍(lán)染色 終止反應(yīng)后，吸去培養(yǎng)液，加入終濃度為40 g·L-1的臺盼藍(lán)染液，室溫染色3 min，倒置顯微鏡下觀察，并計數(shù)200個細(xì)胞中染色的細(xì)胞數(shù)，計數(shù)細(xì)胞的脫顆粒率，脫顆粒率/%=染色細(xì)胞數(shù)/200個細(xì)胞數(shù)×100%

2.4.3β-氨基己糖胺酶釋放率檢測 終止反應(yīng)后，吸取培養(yǎng)液，離心取上清50 μL于96孔板中，同時用0.1% TritonX-100裂解空白對照組細(xì)胞，收集裂解液，離心取上清50 μL作為總酶上清液于96孔板中。加入1 mmol·L-1的底物(0.1 mol·L-1，pH 5的檸檬酸鈉緩沖溶液配制)50 μL，同時設(shè)置空白對照孔，37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h。加入150 μL 0.1 mol·L-1的Na2CO3/NaHCO3(pH 10.5)緩沖液終止反應(yīng)，于酶標(biāo)儀405 nm測吸光度值，計算β-氨基己糖胺酶稀釋率，β-氨基己糖胺酶釋放率/%=(A實驗組上清-A空白組上清)/(A總酶孔上清-A空白組上清)×100%

2.5 VYAC對C48/80刺激的RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒的影響取對數(shù)生長期細(xì)胞，以2×108·L-1細(xì)胞懸液1 mL接種于24孔板，37 ℃培養(yǎng)箱過夜，1 mL PBS洗滌2次，加入1 mL終濃度為6.25、12.5、25、50、100、200、400、800 mg·L-1的VYAC培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，同時設(shè)置不加藥對照孔，然后加入終濃度為100 mg·L-1的C48/80繼續(xù)孵育1 h，對照孔加入等量的PBS，冰浴10 min終止反應(yīng)，離心取上清。臺盼藍(lán)染色，計算細(xì)胞脫顆粒率；檢測上清中β-氨基己糖胺酶含量，計算稀釋率；檢測上清中組胺含量，根據(jù)組胺ELISA試劑盒操作手冊檢測上清中的組胺含量。

2.6 VYAC對C48/80刺激的RBL-2H3細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響取對數(shù)生長期細(xì)胞，以2×108·L-1細(xì)胞懸液2 mL接種于6孔板，37 ℃培養(yǎng)箱過夜，分別加入終濃度為25、50、100 mg·L-1的VYAC培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，然后加入終濃度為100 mg·L-1的C48/80繼續(xù)孵育1 h。消化細(xì)胞，用無鈣的D-Hanks緩沖液洗2遍，加入100 μL 的Fluo-3AM (終濃度為5 μmol·L-1) 避光孵育30 min，離心去上清，用無鈣的D-Hanks緩沖液洗2遍，去除殘留的Fluo-3AM，加入200 μL無鈣的D-Hanks緩沖液繼續(xù)孵育30 min，確保Fluo-3AM在細(xì)胞內(nèi)完全酯化，倒置熒光顯微鏡觀察熒光強弱并拍照。

2.7 VYAC對C48/80刺激的RBL-2H3細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響取對數(shù)生長期細(xì)胞，以2×108·L-1細(xì)胞懸液2 mL接種于6孔板，37 ℃培養(yǎng)箱過夜，分別加入終濃度為25、100 mg·L-1的VYAC培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，然后加入終濃度為100 mg·L-1的C48/80繼續(xù)孵育1 h。RIPA裂解液提取蛋白，蛋白定量變性后。SDS-PAGE凝膠電泳分離，上樣量30 μg，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照，并用灰度分析軟件對所得條帶進行定量分析，β-actin作為內(nèi)參。

3 結(jié)果

3.1 VYAC不影響RBL-2H3細(xì)胞存活Fig 1的CCK-8結(jié)果顯示，VYAC在劑量800 mg·L-1以下時對細(xì)胞的存活率無明顯影響，差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)，只有在1 000 mg·L-1的劑量時才顯示一定的抑制作用(P<0.01)。

Fig 1 Effect of VYAC on survival rate of

**P<0.01vscontrol (0 mg·L-1)

3.2 C48/80刺激RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒RBL-2H3細(xì)胞加入C48/80(5、10、50、100、150、200、250、300 mg·L-1)培養(yǎng)液孵育1 h，從形態(tài)學(xué)可以看出，不加C48/80的細(xì)胞呈梭形，10 mg·L-1的C48/80少數(shù)細(xì)胞變圓，50 mg·L-1的C48/80大多數(shù)細(xì)胞變圓、膨脹，≥100 mg·L-1的C48/80細(xì)胞基本變圓，膨脹(Fig 2A)。臺盼藍(lán)染色結(jié)果顯示(Fig 2B)，不加C48/48細(xì)胞形態(tài)正常，未染色，加不同濃度的C48/80細(xì)胞不同程度的染色，但C48/48濃度為100 mg·L-1時，細(xì)胞大部分染色，且細(xì)胞脫顆粒達(dá)74%(Fig 2D)。由β-氨基己糖胺酶釋放結(jié)果知(Fig 2C)，在一定范圍內(nèi)，隨著C48/80濃度增加，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中β-氨基己糖胺酶釋放也增加，但C48/48濃度≥100 mg·L-1時，β-氨基己糖胺酶釋放達(dá)最大值，且變化不大。由以上結(jié)果得出，C48/80濃度為100 mg·L-1時，RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒效果最明顯，后續(xù)實驗以此濃度來刺激細(xì)胞脫顆粒。

3.3 VYAC抑制C48/80誘導(dǎo)的RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒100 mg·L-1的C48/80刺激RBL-2H3脫顆粒，不同終濃度的VYAC(6.25、12.5、25、50、100、200、400、800 mg·L-1)培養(yǎng)液作用下，與對照組相比，VYAC明顯抑制β-氨基己糖胺酶和組胺的釋放(P<0.05)，且呈劑量依賴(Fig 3A、3B)。臺盼藍(lán)染色結(jié)果(Fig 3C、3D)示，C48/80刺激后，細(xì)胞大部分染色，脫顆粒率達(dá)77%，紫花地丁止癢復(fù)方(25、50、100 mg·L-1)作用后，細(xì)胞染色情況逐漸減少，脫顆粒率也減少，差異具有顯著性(P<0.05)。

3.4 VYAC降低C48/80刺激的RBL-2H3細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度，100 mg·L-1的C48/80刺激RBL-2H3細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)熒光強度明顯增強，表明細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+明顯增多，VYAC(25、50、100 mg·L-1)作用于細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)熒光強度逐漸減弱，表明VYAC能夠有效抑制C48/80刺激的RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒(Fig 4)。

3.5 VYAC調(diào)控C48/80刺激的RBL-2H3細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)Fig 5的Western blot結(jié)果顯示，100 mg·L-1的C48/80刺激RBL-2H3細(xì)胞后相關(guān)蛋白明顯發(fā)生變化，與對照組相比，C48/80刺激使Syk蛋白發(fā)生磷酸化，是正常對照組的2.31倍，PI3K的表達(dá)升高至3.32倍，Akt蛋白發(fā)生磷酸化，是正常對照組的2.90倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但是Syk和Akt的表達(dá)變化不明顯。VYAC作用后明顯抑制這種變化，相比模型組，VYAC(25 mg·L-1)分別使p-Syk降低了46.69%，PI3K的表達(dá)降低了6.16%，p-Akt降低了25.67%；VYAC(100 mg·L-1)分別使p-Syk降低了86.68%，PI3K的表達(dá)降低了77.23%，p-Akt降低了46.24%，差異就有統(tǒng)計意義(P<0.05)，但是對Syk和Akt的表達(dá)變化不明顯。

4 討論

肥大細(xì)胞的激活引起細(xì)胞脫顆粒是過敏反應(yīng)的主要特征，其釋放出的活性介質(zhì)(組胺、β-氨基己糖胺酶、白三烯、前列腺素等)及促炎細(xì)胞因子(IL-4、TNF-α、IL-1β等)，是促進過敏性皮炎發(fā)生發(fā)展的主要因素。肥大細(xì)胞膜表面具有豐富的高親和力的IgE受體(FcεR1)，當(dāng)機體再再次接觸過敏原時，Th2細(xì)胞迅速將特異性IgE抗原呈遞到肥大細(xì)胞表面，與高親和力的IgE受體(FcεR1)結(jié)合，激活肥大細(xì)胞發(fā)生脫顆粒[5]。大量的研究顯示，脾酪氨酸激酶(Syk)是FcεR1介導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒的一個很關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子[8]，抑制Syk磷酸化可以阻斷肥大細(xì)胞脫顆粒現(xiàn)象[9]。抗原特異性的 IgE與高親和力的IgE受體(FcεR1)結(jié)合，使Syk磷酸化，并且激活下游的信號分子PLC-γ及PI3K，使Akt磷酸化，Ca2+內(nèi)流，造成細(xì)胞脫顆粒，釋放活性介質(zhì)[10]。同時，細(xì)胞內(nèi)高濃度的Ca2+激活PKC及NF-κB信號通路，釋放炎癥相關(guān)因子，引起炎癥反應(yīng)[11-12]，促進過敏性皮炎的發(fā)生發(fā)展。

Fig 2 Effects of C48/80 on degranulation of RBL-2H3 cells n=3)

A: Cell morphological change induced by different mass concentrations of C48/80; B: Trypan blue staining after treated with C48/80; C: β-hexosaminidase release of cells induced by different mass concentrations of C48/80; D: Cell degranulation rate induced by different mass concentrations of C48/80.#P<0.05,##P<0.01vscontrol group (0 mg·L-1).

VYAC是根據(jù)臨床經(jīng)驗所得出的治療外科許多疾病所表現(xiàn)出的瘙癢癥狀的方劑，由紫花地丁、苦參、白鮮皮組成。因《內(nèi)經(jīng)》中病機理論有云：“諸痛瘡瘍，皆屬于心”，而方中紫花地丁苦寒，又歸心、肝經(jīng)，功善清熱解毒、消癰散結(jié)，是以在本方中為君藥[13]。臣以苦參，因其性味苦寒，且入心、肝、胃、大腸及膀胱經(jīng)，善祛風(fēng)、殺蟲止癢為諸多皮膚頑疾所常用[14-15]。而白鮮皮性味苦寒，功善清熱燥濕、解毒、祛風(fēng)止癢，為治療皮膚濕疹、濕瘡、疥蘚的常用藥。與苦參配伍煎湯外用有良好的祛風(fēng)止癢作用。縱觀全方以清熱燥濕和祛風(fēng)藥為主，雖然只有紫花地丁等三味藥組成，但三味藥都針對現(xiàn)在臨床所見的引起瘙癢的主要病因即濕熱毒邪和風(fēng)邪進行治療。

Fig 3 Effects of VYAC on degranulation of RBL-2H3 cells stimulated by C48/80 n=3).

A: The β-hexosaminidase release after treated with VYAC; B: The histamine release after treated with VYAC; C: Trypan blue staining after treated with VYAC; D: Cell degranulation rate after treated with VYAC.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsC48/80 group.

Fig 4 Effects of VYAC on intracellular concentration of Ca2+ in RBL-2H3 cells stimulated by C48/80

綜上，VYAC對RBL-2H3顯示很小的毒性；而且對C48/80誘導(dǎo)的RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒有明顯的抑制作用；對組胺、β-氨基己糖胺酶的釋放呈劑量依賴的抑制；能夠明顯抑制致敏肥大細(xì)胞Ca2+內(nèi)流，降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度；而且能夠抑制Syk、AKT磷酸化，降低PI3K蛋白表達(dá)。VYAC抑制RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒機制可能通過Syk/PI3K/Akt通路，從而抑制Ca2+內(nèi)流，抑制脫顆粒。

Fig 5 Effects of VYAC on expression of related proteins in RBL-2H3 cells stimulated by C48/80 n=3)

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsC48/80 group.

(致謝：本實驗在上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院中心實驗室完成，在此感謝王冰老師在實驗中給予的幫助與支持。)