黑質注射LPS構建亞急性帕金森病模型的評價

劉家岐，趙 明，楚世峰，陳乃宏，張大永

(1.中國藥科大學藥物科學研究院，南京 210009；2. 北京醫院藥學部，北京 100730;3.中國醫學科學院神經科學中心，北京 100050)

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是導致中老年人致死致殘的主要神經退行性疾病之一。PD患者常伴有震顫和運動遲緩等運動癥狀[1]，并以黑質處多巴胺(dopamine,DA)能神經元進行性變性丟失和黑質致密部殘存的神經元內出現路易小體[α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-Syn)為其主要成分]為主要病理特征[2]。帕金森病的發病機制有很多，其中神經炎癥(主要指小膠質細胞的快速激活)和PD發病過程之間存在著重要的聯系[3]。

目前公認的研究炎癥機制最常用的PD模型是脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)動物模型[4]。最初的LPS腹腔注射小鼠模型[5, 6]，因外周注射的LPS不能通過血腦屏障，且并不專一性地刺激黑質部位的小膠質細胞，而具有造模周期長，專一性不強等缺點。相比之下，黑質部位定位注射LPS就可以特異性地激活黑質區域的小膠質細胞，排除因其他神經退行性疾病特征腦區的小膠質細胞激活而帶來的干擾。再者，Castao等[7]早在1998年建立的LPS經單側黑質誘導的PD大鼠模型中，只觀察了黑質內DA能神經元和小膠質細胞的變化，卻缺少對PD標志性病理指標α-Syn的檢測。

本研究采用腦內置管微量給藥系統在雙側黑質連續5 d注入LPS，建立亞急性PD小鼠模型，發現該PD小鼠模型不僅具備PD樣行為，神經炎癥反應，而且可模擬PD的病理學特征，顯著提升中腦內α-Syn的單體、寡聚體和磷酸化水平，為從神經炎癥解析PD病理學改變提供了潛在的動物模型，也為炎癥靶點抗PD藥物的研發奠定了理論的基礎。

1 材料

1.1 動物60只健康的♂ C57/BL小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SYXK(京)2014-0023。體質量(25～30) g，鼠齡9～10周，清潔級。所有動物飼養于明暗交替的中國醫學科學院藥物研究所動物房，濕度55%±5%，溫度(22.0±2.0) ℃，實驗過程中自由進食飲水。

1.2 試劑LPS(Sigma-Aldrich公司，批號：028M 4094V)、anti-β-actin(Sigma-Aldrich公司)； anti-α-Syn、anti-TH(Santa Cruz 公司); α-Syn 5G4(Millipore 公司)；p-α-Syn(Abcam公司)；HRP 標記的二抗(KPL公司)；DAB顯色液(北京中杉金橋)；生理鹽水(四川科倫，批號：M18062105-2)；TRIzol(Invitrogen公司，批號：248201)；氯仿、異丙醇(北京市通廣精細化工公司，批號:20181015)；TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒(北京全式金，批號：N20426)、TransStart Tip Green qPCR Supermix試劑盒(北京全式金，批號：N10710)；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、ECL超敏發光液(北京普利萊)。

Fig 1 Scheme of experimental procedure

1.3 儀器與設備小動物麻醉機、雙管微量給藥系統、大小鼠腦立體定位儀(深圳瑞沃德)、微量注射泵(保定雷弗流體公司)、冰凍切片機(Leica公司)、Image Quant LAS 4000 min影像分析儀(GE公司)、臺式冷凍離心機(Sigma公司)、酶標儀(Thermo公司)、大小鼠轉棒儀(IITC Life Science公司)、YLS-13A大小鼠拉力測定儀(濟南益延公司)、LineGene 9600 Plus 熒光定量PCR檢測系統(杭州博日公司)。

2 方法

2.1 PD小鼠模型制備及分組60只小鼠適應1周后開展行為學訓練，剔除掉四肢運動不協調的小鼠后隨機分組。空白組，20只，不給予任何處理。模型組，20只，雙側黑質注入溶于生理鹽水的脂多糖溶液(2.5 μg/側)。溶劑組，20只，在腦內相同的位點處注入無菌生理鹽水。對溶劑組和模型組的小鼠進行異氟烷氣體麻醉后，在黑質處植入雙位點的腦內導管(AP-3.28 mm,ML-1.50 mm,DV-4.60 mm)，并用牙托水泥固定在顱骨上。埋管結束休息8 d后，使用5 μL微量注射器通過注射內管向模型組小鼠黑質內注入LPS溶液(每側2 μL),注射完成后針頭繼續保持5 min，防止液體溢出而影響模型的建立。LPS溶液連續給予5 d，每天注射的時間一致。溶劑組以同樣的方法注入無菌的生理鹽水。實驗進程如Fig 1所示。

2.2 行為學檢測LPS連續注射5 d后，對各組小鼠進行滾軸實驗、爬桿實驗和抓力實驗的行為學檢測。所有行為學實驗均置于安靜的動物實驗操作間內進行。

2.2.1滾軸實驗 將小鼠置于轉棒儀上通過小鼠在轉棒上的潛伏時間來評價小鼠的運動協調能力[8]。參數設置為初始速度5 r·min-1，終止速度30 r·min-1，勻加速運行5 min。小鼠按照與轉棒相反的運行方向運動，一共測量3次并取平均值來分析，每次間隔30 min以上。

2.2.2爬桿實驗 各組小鼠通過測試其在自制爬桿設備上的爬下時間來檢測小鼠肢體的協調能力[9]。爬桿裝置由纏有紗布的長50 cm直徑1 cm的木桿組成，木桿頂端有一小木球。將自制的爬桿裝置底部與木桿垂直，并放置于大的飼養籠中，底部用墊料覆蓋。記錄各組小鼠3次的爬下時間并取平均值，每次測量間隔30 min以上。

2.2.3抓力實驗 將小鼠抓力測定儀水平放置于實驗操作臺，確保抓力板呈水平方向運動。將小鼠輕輕地放在抓力板上，手持小鼠尾部均勻用力后拉，直到小鼠松開前肢，在儀器上記錄下小鼠的抓力。每只小鼠測定6次抓力，并取平均值用于后續統計分析。

2.3 組織樣本及切片制備取每組的10只小鼠麻醉后固定在灌流操作臺上，剪開肋骨，暴露心臟，用灌滿0.01 mol·L-1PBS的注射針頭經心臟灌流，剪開右心耳，待肝臟變白后，換為4%的多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)溶液進行灌注固定。四肢僵硬后，對小鼠進行斷頭取腦，小心地將腦組織剝離至裝有4% PFA溶液的樣本瓶中固定24 h。而后，將小鼠全腦組織用質量分數為10%、20%、30%的蔗糖PFA溶液進行梯度脫水。包埋劑保護后，將腦組織置于冷凍切片機內進行20 μm冠狀切片的制備。每只小鼠的平均地從黑質頭側至尾側選取30張制備冰凍切片，儲存于-20 ℃冰箱。剩余每組的10只小鼠取中腦和紋狀體組織冷凍于-80 ℃冰箱儲存。

2.4 免疫組織化學檢測將冰凍切片置于37 ℃烘箱平衡30 min后，浸泡在抗原修復液內熱修復10 min。冷卻至室溫后，用0.01 mol·L-1PBS溶液洗滌3次，每次5 min。接下來，用1% Triton-100 PBS溶液室溫浸泡10 min。洗滌3次后，用3%的過氧化氫室溫避光孵育10 min。再次洗滌3次，用5%的BSA封閉30 min。封閉液清除后，切片用酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)(1 ∶400)，離子鈣接頭蛋白1(ionized calcium binding adapter molecule-1，IBA-1) (1 ∶200) 的一抗4 ℃孵育過夜。PBST緩沖液洗滌3次后，滴加用辣根過氧化酶標記的二抗室溫孵育2 h。再次洗滌3次后，使用DAB顯色試劑盒顯色。切片梯度酒精脫水后，在二甲苯 Ⅰ(Ⅱ)中各浸泡5 min，在切片上滴加中性樹脂封片。在顯微鏡下觀察，拍攝代表性的圖片，用Image pro Plus6.0軟件進行統計分析。

Fig 2 Behavioral results of three groups of mice

A: Rotarod test:the latent time.B: Pole test: the climbing down time. C:Grip strength test: the grip strength.##P<0.01vsvehicle group

2.5 實時定量PCR分析使用TRIzol從中腦組織中提取總RNA，用Nano核酸定量儀測定RNA的濃度及純度。使用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒將RNA全部逆轉錄為cDNA。使用TransStart Tip Green qPCR Supermix試劑盒將1 μg RNA合成的cDNA用AB 7900HT快速實時定量PCR系統進行cDNA的擴增。并采用ΔΔCT的相對定量方法進行統計分析。每種目標基因的引物見Tab 1。

Tab 1 Primers for qPCR analysis

2.6 蛋白免疫印跡分析使用RIPA裂解液從中腦組織中提取出蛋白上清，并用BCA試劑測定濃度。采用SDS-PAGE電泳分離蛋白質(每個30 μg),轉移到PVDF膜上。PVDF膜用質量分數為5%的 BSA室溫封閉2 h后，孵育一抗4 ℃冰箱中過夜：抗α-synuclein (1 ∶200),抗α-synuclein(5G4)(1 ∶1 000)，抗磷酸化α-synuclein(1 ∶500)和內參β-actin(1 ∶1 000)。TBST緩沖液洗滌3次后，室溫孵育各自條帶對應的二抗2 h。洗滌3次后，室溫孵育三抗(1 ∶5 000)1 h。再次洗滌3次后，用ECL發光試劑盒將膜條帶化學曝光并用影像分析儀掃描記錄圖像。用Image J軟件進行進一步的條帶定量分析。

靶向抗腫瘤單克隆抗體類藥物聯合常規化療方案治療轉移性結直腸癌的臨床進展 ………………………… 趙源浩（14）：2012

3 結果

3.1 雙側黑質注射LPS可誘導小鼠出現PD樣行為學障礙靜止性震顫是PD典型的運動障礙，在小鼠上表現為運動協調性的降低。如Fig 2所示，在滾軸實驗中，與溶劑組相比，模型組小鼠在滾軸上的潛伏時間顯著縮短(P<0.01)，從爬桿頂端到底端的用時顯著延長(P<0.01)和基礎抓力明顯變小(P<0.01)。與空白組相比，溶劑組小鼠的潛伏時間、爬下時長和基礎抓力無顯著的變化，表明本實驗的造模方法對小鼠不產生行為學的改變。

3.2 雙側黑質注射LPS誘導小鼠黑質DA能神經元受損為了確定小鼠的整個黑質中DA能神經元丟失的程度和模式，對溶劑組和模型組中各一只小鼠的30張黑質切片進行全部免疫組化染色，計數并統計每一張黑質切片中DA能神經元的數目。統計結果如Fig 3所示。因此，在后續的實驗中，我們選取30張切片中的第10到第15張黑質切片進行染色分析。

如Fig 4所示，模型組小鼠黑質致密部的DA能神經元的數目對比溶劑組顯著減少，并具有統計學差異(P<0.01)。溶劑組黑質處多巴胺能神經元的個數與空白組的數目相近，無統計學差異。

Fig 3 Quantitative analysis of LPS-induced loss

Thirty coronal sections from rostral to caudal were taken from brains injected intranigrally with saline (2 μL) or LPS (2 μL; 5 days) and immunostained with an anti-TH antibody. The number of TH-positive neurons in the SN was visually counted under a microscope. The results shown are from one representative set of sections from one brain, and similar results were obtained with sections from two other brains.

Fig 4 Effect of LPS on TH expression in midbrain

A:Representative photomicrograph of TH-immunoreactive neurons across groups. (scale bar = 400 μm) B: A histogram representing the quantitative analysis of TH-positive cells normalized to control levels is shown.##P<0.01vsvehicle group

Fig 5 Effect of LPS on activation state of microglia

A: Representative photomicrograph of IBA-1-immunoreactive cells across groups. (scale bar=400 μm) B: A histogram representing the quantitative analysis of IBA-1-positive cells normalized to control levels is shown.##P<0.01vsvehicle group

3.3 雙側黑質注射LPS可誘導小鼠黑質內小膠質細胞的激活小膠質細胞是介導神經炎癥反應過程中起著非常重要作用的神經膠質細胞。如Fig 5所示，LPS的暴露造成了模型組小鼠黑質部位的小膠質細胞大量激活。與溶劑組相比，模型組小鼠黑質區域IBA-1免疫陽性的小膠質細胞數目顯著增加(P<0.01),且具有統計學差異。而溶劑組小鼠黑質IBA-1免疫陽性小膠質細胞的數目對比空白組，無明顯的統計學差異。

3.4 雙側黑質注射LPS可誘導小鼠中腦內炎癥因子mRNA的表達上調我們運用實時定量PCR技術觀察小鼠中腦內促炎性細胞因子mRNA的表達變化。如Fig 6所示，和溶劑組相比，LPS炎癥PD模型小鼠中腦內炎癥因子TNF-α (P<0.01)和IL-1β (P<0.01)的mRNA表達水平顯著上調,且具有統計學差異。同樣，溶劑組小鼠中腦內炎癥因子的表達水平與空白組無顯著的差異。

3.5 雙側黑質注射LPS可誘導小鼠中腦內不同形式的α-Syn表達增加如Fig 7A和7B所示，我們采用Westernblot 方法檢測了單體形式的 α-Syn、寡聚體形式的α-Syn(5G4)和磷酸化形式的 α-Syn(Ser129)在小鼠黑質部位的表達。和溶劑組相比，模型組小鼠黑質部位單體形式的α-Syn的蛋白表達顯著增加(P<0.01)。同樣地，LPS的作用使小鼠黑質部位磷酸化形式的α-Syn表達明顯上調(P<0.01)。接下來，我們進一步用α-Syn(5G4)來更全面地檢測小鼠黑質部位中的α-Syn。如Fig 7C所示，模型組小鼠黑質部位的聚集化的α-Syn表達增加，與溶劑組相比具有統計學差異(P<0.01)。而溶劑組小鼠中腦內單體形式、寡聚體形式和磷酸化形式的α-Syn的表達水平與空白組相比差異無顯著性。

Fig 6 Effect of LPS on mRNA expression of TNF-α and

A: TNF-α; B: IL-1β. The relative mRNA level was normalized to GAPDH mRNA.##P<0.01vsvehicle group

4 討論

本次研究中，考慮到多次連續定位注射LPS至小鼠的黑質，容易因機械手術損傷而增加死亡率，于是我們引入了雙位點腦內置管微量給藥系統，對傳統的LPS大鼠模型建立方法進行了優化改進[10]，大大降低了連續多次黑質處注射造成的死亡率，也減少了連續多次的注射位點誤差。

在本次的研究結果中，行為學結果顯示，LPS模型組小鼠的滾軸潛伏期顯著縮短、爬下時間延長和前肢的抓力顯著下降，表明LPS造模后的小鼠運動協調性差、運動變遲緩和肌肉張力下降。同時，模型組小鼠表現出肢體僵硬、姿態不穩及一些震顫的跡象，與PD患者的臨床運動癥狀相符[11]。

本實驗的病理學結果同樣也表明，模型組小鼠黑質致密部的DA能神經元受損嚴重、大量小膠質細胞激活和黑質內炎癥因子mRNA的水平上調顯著。在LPS經黑質注射的大鼠模型的研究中，Castao等[7]已經發現LPS可以造成大鼠黑質部位多巴胺能神經元的不可逆性損毀。大多數PD病人的尸檢結果也已經表明[12]，患者腦內存在大量的激活態小膠質細胞。小膠質細胞是介導神經炎癥反應的膠質細胞中重要的組成部分，對其激活狀態的檢測有助于判斷LPS是否在小鼠黑質處產生炎癥[13]。而其分泌的TNF-α和 IL-1β 等致炎性細胞因子可以導致多巴胺能神經元的變性，是神經炎癥造成PD樣病理表現的重要機制。因此，本亞急性PD小鼠的病理結果與PD患者的尸檢結果相符,此炎癥PD模型建立成功。

在PD的病因探究過程中，Spillantini等[14]在1997年最先在PD患者腦內觀察到α-Syn這種神經元蛋白。并且目前普遍認為 α-Syn是PD的重要病理及診斷特征的重要蛋白標志，它的異常聚集與PD的發生發展密切相關。針對α-Syn三種不同的形式，我們運用相應的抗體對三組小鼠黑質部位的α-Syn進行了檢測。蛋白免疫印跡結果表明，LPS經黑質誘導的小鼠中腦內單體形式、寡聚體形式和磷酸化形式的α-Syn的蛋白表達水平增加。且已有文獻報道[15]，磷酸化α-Syn水平增加可以引起DA能神經元的毒性損傷。因此，本次建立的LPS亞急性PD小鼠模型不僅成功模擬了PD樣的行為學障礙和炎癥相關的PD病理學改變。更是觀察到模型組小鼠在PD典型腦區黑質內出現α-Syn的聚集和異常改變等PD的診斷性指標，使此亞急性PD模型的專一性更強，此炎癥PD模型的建立更具意義。

綜上所述，LPS經黑質誘導的小鼠可以出現PD樣運動障礙，PD樣病理表現和PD診斷標志蛋白。此神經炎癥的亞急性PD小鼠模型模型持續、穩定且造模時間短，為抗PD新藥的臨床前篩選提供了新途徑，也為PD免疫炎癥發病機制的探究過程中轉基因小鼠的使用奠定了基礎。

Fig 7 Effects of LPS on α-synuclein expression in midbrain of

A: Representative protein bands of α-synuclein detected by α-synuclein and β-actin and a histogram representing the quantitative analysis of α-synuclein levels normalized to β-actin protein levels are shown. B: Representative protein bands of α-synuclein detected by p-α-synuclein and β-actin and a histogram representing the quantitative analysis of p-α-synuclein levels normalized to β-actin protein levels are shown. C: Representative protein bands of α-synuclein detected by α-synuclein(5G4) and β-actin and a histogram representing the quantitative analysis of α-synuclein(5G4) levels normalized to β-actin protein levels are shown.##P<0.01vsvehicle group