自貢地區HBV基因BCP區1762/1764及前C區1896位點突變與HBV相關性肝癌的相關性研究

邱順華 張德文 劉勇

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）的感染仍是全球性的問題，乙肝病毒感染的三部曲：慢性乙肝（Chronic hepatitis B，CHB）、肝硬化（liver cirrhosis，LC）、肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），是嚴重影響乙肝患者健康和經濟的重大疾病。全球約有2.4億慢性乙肝患者，這也是HCC發生的主要致病因素[1-2]。HCC是全球范圍內最常見的惡性腫瘤之一，發病率居惡性腫瘤的第六位，死亡率居癌癥患者死亡原因的第三位[3]。HCC居自貢地區惡性腫瘤發病率和死亡率的第二位，嚴重危害當地居民的生命和健康[4]。

HBV復制要經過逆轉錄，而逆轉錄酶缺乏有效的堿基校正修復功能，容易發生自然變異，發生變異后容易對藥物耐藥及危害加大[5]。HBV核心啟動子（basal core promoter，BCP）區1762/1764突變的HBV較野生型HBV具有更強的復制能力及對藥物的低敏感性，與活動性肝炎、肝硬化、HCC、急性肝功能衰竭等相關[6-7]。HBV前C區（precore，PC）1896是HBV的常見變異，是影響藥物持續療效的一個重要因素[8]。同時有研究表明HBV BCP區1762/1764突變、前C區1896位點突變與乙肝患者病情正相關[9]，但也有報道這些HBV基因突變與HCC的關系存在爭議。HBV基因型的分布存在著地理性差異，與HCC的關系尚未完全明確[10]。

本文對自貢地區CHB、LC和HCC患者的HBV基因型、BCP區1762/1764及前C區1896位點基因突變進行檢測，探索HBV基因型及基因突變與本地區HCC的關系，對指導自貢地區HBV相關性HCC的臨床早期診斷與提前干預提供一定的科學依據。

1 材料和方法

1.1 一般資料

標本收集本院2015年9月至2018年6月門診和住院患者，經本院確診的乙肝性相關疾病患者：慢性乙肝患者（CHB組）50例，肝硬化（LC組）45例，肝癌（HCC組）46例，且患者血清HBV-DNA水平≥103IU/mL，男性患者99例，女性患者42例，平均年齡（52.57±12.44）歲，其中HCC組、LC組、CHB組患者的平均年齡分別為（56.54±12.15）歲、（55.80±9.17）歲、（46.00±12.76）歲。乙肝相關疾病患者的診斷根據《慢性乙型肝炎診斷標準（2015年版）》[11]。排除標準：①重疊或合并感染其他肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒；②轉移性肝癌；③其他非HBV感染導致的肝癌；④伴有其他惡性腫瘤病史。

1.2 儀器與試劑

主要儀器：SLAN-96P實時熒光定量PCR儀（上海宏石醫療科技有限公司），生物安全柜（博科控股集團有限公司），冷凍高速離心機TGL-16R（珠海黑馬醫學儀器有限公司）。試劑：乙型肝炎病毒前C區1896位點基因突變檢測試劑盒和乙型肝炎病毒BCP區1762/1764位點基因突變檢測試劑盒由武漢百泰基因工程有限公司提供，乙型肝炎病毒基因分型檢測試劑盒由湖南圣湘生物科技有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 研究標本的收集

收集CHB、乙肝相關性LC、乙肝相關性HCC患者的血清作為研究標本，首先用紅頭管采集3mL左右血液，然后4000r/min離心5min分離血清，收集500μL左右血清標本分裝于1.5mL離心管內，置于-20℃保存備用。

1.3.2 HBV基因分型檢測

HBV基因分型檢測采用多通道熒光PCR法。檢測原理：采用核酸釋放劑快速裂解和釋放血清樣本中的乙型肝炎病毒DNA，針對乙型肝炎病毒B、C和D型序列設計3套特異牲引物及熒光探針，配成PCR反應液，然后在實時熒光定量PCR儀上，采用多通道熒光PCR法對B、C和D基因型進行分型檢測。實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.3 HBV前C區1896位點及BCP區1762/1764位點基因突變檢測

HBV基因位點突變檢測采用擴增阻滯突變系統（amplification refractory mutation system，ARMS）熒光PCR法（ARMS-PCR）[12]。檢測原理：設計兩條特異性引物A和B，對野生型和突變型序列的擴增效率不同，造成樣本在兩種PCR反應液下得到的Ct值也不同。實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行：首先采用熱裂解法提取HBV DNA，然后在PCR反應液A和反應液B中進行熒光PCR擴增，擴增結束后，分別記錄PCR反應液A和反應液B擴增所得Ct值，記為Ct（A）和Ct（B）。若|Ct（A）-Ct（B）|≤7.00，則該對應的基因位點存在突變；若|Ct（A）-Ct（B）|＞7.00，則該對應的基因位點未突變或突變型含量低于檢測下限。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行分析。計數資料用n（%）表示；計量資料用（±s），用卡方檢驗。兩組間采用t檢驗；P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 慢性乙肝組、肝硬化組與乙肝相關性肝癌組一般資料比較結果

e抗原陽性率方面比較，HCC組低于CHB組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；HCC組也低于LC組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。HBV DNA含量水平比較，HCC組均低于CHB組和LC組，差異均具有統計學意義（P＜0.05）；HBV DNA＞105%比較，HCC組也均低于CHB組和LC組（P＜0.05），見表1。

表1 慢性乙肝組、肝硬化組與乙肝相關性肝癌組一般資料比較情況[n（%）]Table1 The general clinical data of CHB group，LC group and HBV-HCC group[n（%）]

2.2 乙肝相關疾病患者HBVBCP區1762/1764位點突變情況

乙肝相關患者中，男性與女性患者間的HBV BCP區1762/1764位點突變率差異無統計學意義（P＞0.05）。HBV BCP區1762/1764位點突變率在HCC組與CHB組間的差異具有統計學意義（P＜0.05），而LC組與HCC組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 乙肝相關疾病患者HBVBCP區1762/1764位點突變情況[n（%）]Table2 Mutations of HBV BCP 1762/1764 in hepatitis B-related patients[n（%）]

2.3 乙肝相關疾病患者HBV前C區1896位點情況

乙肝相關患者中，HBV前C區1896位點突變率在男性與女性患者間的差異無統計學意義（P＞0.05）；而在HCC組與CHB組間和HCC組與LC組間的差異均具有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 乙肝相關疾病患者HBV前C區1896位點突變情況[n（%）]Table3 Mutations of HBV PC1896 in hepatitis B-related patients[n（%）]

2.4 乙肝相關疾病患者HBVBCP區1762/1764位點及前C區1896位點突變情況

HCC患者組HBV前C區1896和BCP區1762/1764位點同時突變率為78.3%，明顯高于CHB組患者，差異具有統計學意義（P＜0.05）；同時也高于LC組患者，差異具有統計學意義（P＜0.05）。而BCP區1762/1764單一突變型，主要存在于LC患者中；前C區1896單一突變型和野生型，主要存在于CHB患者中，見表4。

表4 慢性乙肝、肝硬化及肝癌患者HBVBCP區1762/1764位點及前C區1896位點突變分析[n（%）]Table4 Analysis of HBV BCP 1762/1764 and PC1896mutation in HCC，LC and CHB patients[n（%）]

2.5 乙肝相關患者不同HBV基因型的BCP區及前C區突變情況

CHB組、LC組和HCC組乙肝患者中，不同HBV基因型的BCP區1762/1764和前C區1896突變率差異均無統計學意義（P＞0.05）。同時可以看出，無論是B型還是C型的乙肝相關患者，疾病進程較重（HCC組，LC組）的受試者攜帶BCP區1762/1764突變型或前C區1896突變型的比例均高于慢性乙肝患者（CHB組）。各組乙肝患者B基因型與C基因型的BCP1762/1764及PC1896位點突變率比較，P＞0.05差異無統計學意義見見表5。

表5 乙肝相關患者不同HBV基因型的BCP區及前C區突變情況[n（%）]Table5 Association of BCPand PCmutations with HBV genotype[n（%）]

3 討論

乙肝相關性HCC的發病機制涉及因素較多，HBV感染慢性化是導致HCC發生的重要原因之一，HBV在慢性持續感染過程中，在機體自身免疫及藥物的作用下，基因易發生突變，從而使病毒具有更強的致病性，最終導致乙肝慢性化、嚴重化，甚至可能導致癌變[13-14]。本文研究顯示HCC組患者更容易出現血清學HBeAg為陰性，同時HCC組患者HBVDNA含量水平低于CHB組和LC組，可能原因有：①CHB發展到HCC一般需要一個漫長過程，肝細胞內HBV DNA分布從彌散向局灶演變，而外周血釋放HBV的特點為低復制、高積累、低排除；②HBV基因整合到肝細胞基因組，從而降低HBV復制能力[15]。

HBV基因突變在肝癌發展過程中起到重要角色，與HCC發展密切相關的HBV基因突變區域有核心啟動子區域（BCP）、前S基因系列、前C區等[16-17]。Fang等[18]前瞻性研究發現HBV BCP區1762/1764突變者患HCC的發病率要遠高于未突變者。Xu等[19]研究表明HBV攜帶者，疾病進程較重的受試者攜帶HBVBCP區1762/1764突變型的比例明顯增高。本文研究顯示，自貢地區HCC患者HBVBCP區1762/1764突變率高于CHB組患者，而與LC組比較差異無統計學意義，該結果表明HBVBCP區1762/1764突變與肝癌和肝硬化的發生密切相關；但HBVBCP區1762/1764突變不能作為區分肝硬化進展為肝癌的標記物，與閃明海等[20]研究結論存在一定差別；同時本研究結果表明HBV基因BCP區突變是慢性乙肝進展為肝硬化的致病因素，但可能不是肝癌的主要致病因素[21]。HBV前C區1896位點突變是HBV的常見突變位點，MalikA等[22]研究發現HBV前C區1896突變率在CHB、LC及HCC患者中逐漸升高。本文研究提示自貢地區HCC患者HBV前C區1896突變率高于CHB組和LC組患者，結果表明HBV前C區1896突變可能與HCC發生密切相關。

本文研究還發現，HCC組HBV前C區1896和BCP區1762/1764位點同時突變率最高，結果表明HBV兩個基因位點同時突變可能導致慢性HBV感染患者病情更易嚴重化，與HC C的發生可能存在一定關系。HBV基因型的分布存在地域和人種的差異[10]。本文研究結果顯示無論是B型還是C型的乙肝相關患者，疾病進程較重（HCC組、LC組）的患者攜帶BCP區1762/1764突變型或前C區1896突變型的比例明顯高于CHB組患者，但是乙肝患者各個階段HBV基因B型和C型的兩個區域突變比例差異均無統計學意義，與徐君等[23]研究江蘇地區情況不一致，可能原因：①不同地區HBV基因亞型不一樣，②生活習慣或環境可能會影響HBV突變，③可能存在其他基因區域合并突變，④本文研究對象CHB樣本量相對較少，有待于進一步提高樣本量深入研究。

綜上所述，本文從HBV基因型及基因變異角度闡述了CHB、LC與HCC之間的關系。本文研究結果對了解自貢地區HBV相關性肝癌的發病病因提供了有意義的資料，對指導本地區HBV相關性HCC的臨床治療、早期診斷與提前干預提供了一定的科學依據。