妊娠期糖尿病孕婦孕期氧化應(yīng)激水平分析

余 俊，賈 靜，曾 宇，張婧怡，韋麗杰，王少帥，馮 玲

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 武漢 430030)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是指孕婦既往無明確糖尿病病史，在妊娠期間首次發(fā)生的糖代謝障礙，是妊娠期常見的并發(fā)癥。全世界約15%的孕婦會(huì)合并糖尿病，其中87.5%是GDM[1]。GDM給母胎和新生兒帶來了嚴(yán)重的不良影響，不僅增加了孕婦子癇前期、自身代謝紊亂、剖宮產(chǎn)的發(fā)生率，還增加了流產(chǎn)、早產(chǎn)、難產(chǎn)、巨大兒、胎兒宮內(nèi)窘迫/死亡、新生兒窒息、新生兒肺發(fā)育不成熟、新生兒死亡、新生兒低血糖癥等風(fēng)險(xiǎn)，其中新生兒肺發(fā)育不成熟是導(dǎo)致新生兒窒息甚至死亡的主要原因之一[2]。大多數(shù)患有GDM的婦女在分娩后可恢復(fù)正常的糖代謝，但在以后的生活中患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)增加[3]。因此，GDM被認(rèn)為是糖尿病前期狀態(tài)，兩者的病理學(xué)改變明顯相關(guān)。近年來的研究表明，脂代謝異常能通過介導(dǎo)氧化應(yīng)激等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路廣泛參與肥胖、2型糖尿病等一系列代謝相關(guān)性疾病的病理生理過程[4]。然而，關(guān)于氧化應(yīng)激參與GDM的機(jī)制尚不明朗。炎癥是氧化應(yīng)激的一種表現(xiàn)，氧化應(yīng)激可誘發(fā)產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子α(TNF-α)等。TNF-α擁有較強(qiáng)的生物學(xué)活性，作用于眾多疾病的炎癥反應(yīng)中。TNF-α主要分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞，可直接影響胰島細(xì)胞，造成胰島素抵抗，并最終導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生[5]。8-異前列腺素F2α(8-iso-PGF2α)是異前列腺素中性質(zhì)最穩(wěn)定和含量最多的一種代謝產(chǎn)物，能夠準(zhǔn)確、穩(wěn)定地反映體內(nèi)脂質(zhì)氧化應(yīng)激和脂質(zhì)受自由基誘導(dǎo)后過氧化程度[6]。2型糖尿病患者循環(huán)和尿中的8-iso-PGF2α濃度升高[6-7]。此外，有研究顯示8-iso-PGF2α與胎兒生長受限、胎死宮內(nèi)、胎盤早剝、低出生體重、絨毛膜羊膜炎等相關(guān)[8]。通過對這些因子的特性探討，對預(yù)測及干預(yù)GDM具有潛在的重要意義。

本研究擬通過測定GDM患者及正常孕婦中TNF-α、8-iso-PGF2α的水平差異，探討氧化應(yīng)激與GDM發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性，為GDM患者進(jìn)行孕期抗氧化治療提供依據(jù)；同時(shí)探討孕早期檢測血清TNF-α和8-iso-PGF2α濃度，以預(yù)測GDM發(fā)生的可行性。

1資料與方法

1.1資料來源

選取2016年11月至2017年11月在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院正規(guī)產(chǎn)檢和手術(shù)分娩的孕婦作為研究對象，排除糖尿病、高血壓病、慢性肝腎疾病及甲狀腺等內(nèi)分泌疾病。對孕11～13周經(jīng)超聲確認(rèn)正常單胎妊娠孕婦263例，于孕24～28周行75g口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)，依據(jù)GDM診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]納入GDM患者為GDM組，同期非GDM孕婦為對照組。所有研究對象均簽署知情同意書，并取得醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

根據(jù)OGTT結(jié)果將研究對象分組后，收集研究對象不同孕期的血清樣本。將兩組研究對象根據(jù)孕周分為三期：A組(孕11～13+6周)、B組(孕24～29+6周)、C組(孕37～40+6周)。足月后，于本院分娩的研究對象在胎兒娩出后采集臍血。最終納入25例GDM患者為GDM組，同期25例非GDM患者為對照組。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)

本研究依據(jù)謝幸主編《婦產(chǎn)科學(xué)》：孕24～28周75g OGTT，空腹血糖≥5.1mmol/L，OGTT 1h血糖≥10.0mmol/L，OGTT 2h血糖≥8.5mmol/L，上述血糖之一超標(biāo)即診斷GDM。

1.3檢測方法

在早孕期測量孕婦身高(m)和體重(kg)，計(jì)算身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)，BMI=體重/身高2。所有入組孕婦每次空腹采集靜脈血2mL，分娩時(shí)抽取臍靜脈血3mL。所有血液標(biāo)本緩慢貼壁注入含有肝素鈉的抗凝管中，室溫靜置30min，3 000rpm離心10min后吸取上層血清，存于-80℃冰箱待檢。

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定孕婦外周血和臍血血清中TNF-α和8-iso-PGF2α水平。試劑盒包括純化的羊抗兔IgG抗體包被的微孔板、兔抗人TNF-α或8-iso-PGF2α抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗及相關(guān)試劑組成。在酶標(biāo)儀上進(jìn)行定量檢測。

檢測前1h把試劑盒和待測樣品從-80℃冰箱內(nèi)取出，放在室溫下復(fù)溫。將標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋，將樣品稀釋液作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0g/mL。在酶聯(lián)板上依次設(shè)定空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔。空白孔添加50μL樣品稀釋液，余孔依次加入50μL各濃度的倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品。使用蓋板膜覆蓋酶標(biāo)板，室溫下置于搖床上反應(yīng)。3h后棄去孔內(nèi)液體并甩干，每孔加入檢測工作液，放入37℃溫箱內(nèi)反應(yīng)1h。棄去孔內(nèi)液體，并洗滌3次。依次給每個(gè)孔添加200μL底物溶液，37℃避光顯色45min后終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在405nm波長檢測各孔OD值。利用標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品OD值的對應(yīng)濃度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1一般臨床資料的比較

GDM組與對照組的年齡、孕前BMI、孕產(chǎn)次比較均無顯著性差異(均P>0.05)，見表1。

表1 孕婦的一般情況Table 1 General information of all pregnant

2.2外周血生化指標(biāo)比較

2.2.1對照組各孕期血清TNF-α和8-iso-PGF2α水平的比較

對照組各孕期血清TNF-α水平分別為：A組(11.76±2.94)μg/mL，B組(19.10±4.78)μg/mL，C組(20.94±4.06)μg/mL，孕中期(B組)顯著高于孕早期(A組)(t=6.544，P<0.001)，孕中期(B組)與孕晚期(C組)比較無顯著性差異(t=1.466，P=0.149)。

對照組各孕期血清8-iso-PGF2α水平分別為：A組(114.25±14.72)pg/mL，B組(107.38±27.06)pg/mL，C組(118.66±7.73)pg/mL，孕早期(A組)與孕中期(B組)比較無顯著性差異(t=1.115，P=0.270)，孕中期(B組)與孕晚期(C組)比較無顯著性差異(t=2.004，P=0.051)。

2.2.2 GDM組各孕期血清TNF-α和8-iso-PGF2α水平的比較

患者在確診GDM前血清TNF-α、8-iso-PGF2α水平已升高，并隨著妊娠進(jìn)展逐漸增加。

GDM組各孕期血清TNF-α水平分別為：A組(16.87±2.33)μg/mL，B組(21.67±3.30)μg/mL，C組(25.83±2.88)μg/mL，孕中期(B組)顯著高于孕早期(A組)(t=5.937，P<0.001)，孕晚期(C組)顯著高于孕中期(B組)(t=4.746，P<0.001)。

GDM組各孕期血清8-iso-PGF2α水平分別為：A組(121.63±11.25)pg/mL，B組(150.91±30.89)pg/mL，C組(268.50±25.21)pg/mL，孕中期(B組)顯著高于孕早期(A組)(t=4.454，P<0.001)，孕晚期(C組)顯著高于孕中期(B組)(t=14.747，P<0.001)。

2.2.3 GDM組與對照組各孕期血清TNF-α、8-iso-PGF2α水平的比較

GDM組各孕期血清TNF-α水平均顯著高于對照組(A組：t=6.820，P<0.001，B組：t=2.212，P=0.032，C組：t=4.910，P<0.001)，見圖1；GDM組各孕期血清8-iso-PGF2α水平也均高于對照組，在孕中期(B組)和孕晚期(C組)均有顯著性差異(B組：t=5.301，P<0.001，C組：t=28.414，P<0.001)，而在孕早期(A組)無顯著性差異(A組：t=1.992，P=0.052)，見圖2。

注：*P<0.05。

圖1孕婦外周血TNF-α檢測對比結(jié)果

Fig.1 Comparison of detection result of TNF-α in peripheral blood of pregnant women between the two groups

注：*P<0.05。

圖2孕婦外周血8-iso-PGF2α檢測對比結(jié)果

Fig.2 Comparison of detection result of 8-iso-PGF2α in peripheral blood of pregnant women between the two groups

2.3臍血生化指標(biāo)比較

GDM組臍血TNF-α、8-iso-PGF2α水平均高于對照組，經(jīng)比較均有顯著性差異(均P<0.05)，見表2。

表2 對照組與GDM組臍血TNF-α和8-iso-PGF2α水平的比較結(jié)果Table 2 Comparison of serum levels of TNF-α and 8-iso-PGF2α in umbilical cord blood of the newborns between the control group and GDM

3討論

3.1脂代謝在GDM病理機(jī)制中扮演重要角色

GDM是常見的妊娠期并發(fā)癥，一直以來受到國內(nèi)外醫(yī)學(xué)研究者的廣泛關(guān)注。GDM在不同程度上影響孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒的健康，其影響程度與患者的血糖控制情況有著密切的關(guān)系。GDM會(huì)加大婦女自然流產(chǎn)、早產(chǎn)發(fā)生率，并發(fā)高血壓的概率是健康孕婦的3～5倍。GDM婦女在分娩后10年內(nèi)有20%～70%的概率會(huì)發(fā)展成2型糖尿病患者[3]。糖尿病的病理機(jī)制復(fù)雜，β細(xì)胞功能紊亂、神經(jīng)內(nèi)分泌功能異常、脂代謝異常等均參與GDM的病理發(fā)展[10-11]。目前對于GDM的治療手段有限，僅飲食干預(yù)和胰島素被廣泛接受。然而，由于胰島素抵抗的存在，治療效果往往不理想。所以，深入分析GDM發(fā)病原因、機(jī)理及其治療對策對降低妊娠并發(fā)癥、新生兒患病率等方面具有重要意義。

脂肪組織作為一種重要的內(nèi)分泌器官，既保證了能量的安全分配，又積極分泌循環(huán)因子，包括脂肪因子(如瘦素、脂聯(lián)素等)和細(xì)胞因子[如TNF-α、白介素(IL)-6和IL-1β)]，具有廣泛的代謝作用，并在GDM病理機(jī)制中扮演了重要的角色[4]。本研究通過檢測GDM孕婦血清及臍血中的TNF-α和8-iso-PGF2α進(jìn)一步證實(shí)脂代謝與GDM患者發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。

3.2 GDM患者TNF-α顯著升高與脂代謝密切相關(guān)，且參與GDM發(fā)病機(jī)制

TNF-α是一種重要的脂肪源性促炎介質(zhì)，是參與炎癥、肥胖和胰島素抵抗相關(guān)的主要炎性脂肪因子。TNF-α與糖代謝及脂代謝密切相關(guān)，并且在胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和外周組織胰島素抵抗等方面發(fā)揮重要作用。有研究報(bào)道TNF-α與孕前BMI呈正相關(guān)[12]。TNF-α通過降低過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)的mRNA表達(dá)來減少其產(chǎn)生，而PPAR-γ具有抗炎和促凋亡的作用，同時(shí)可減少體內(nèi)游離脂肪酸的生成，進(jìn)而減少體內(nèi)胰島素抵抗，調(diào)節(jié)血糖平衡。TNF-α不但減少了PPAR-γ的產(chǎn)生，還減少脂肪細(xì)胞分化和脂聯(lián)素表達(dá)，通過多種途徑引起糖代謝失衡[13]。T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白分子-3(Tim-3)可以通過活化核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-kB)/TNF-α通路加重糖尿病腎病，TNF-α還可誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡[14-16]。肺損傷最早出現(xiàn)的異常之一是炎癥細(xì)胞因子水平的升高，其中，TNF-α起著關(guān)鍵作用，對上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性，從而加重水腫[17]。本研究顯示，GDM孕婦外周血和臍血中的TNF-α均高于對照組，并且隨著妊娠進(jìn)程持續(xù)升高，提示GDM孕婦及胎兒均存在脂質(zhì)過氧化。TNF-α在GDM的發(fā)病機(jī)制及子代的肺發(fā)育不良中可能起到重要作用。

3.3 GDM患者8-iso-PGF2α顯著升高，且為評價(jià)氧化應(yīng)激的理想指標(biāo)

8-iso-PGF2α是評價(jià)氧化應(yīng)激的理想指標(biāo)，8-iso-PGF2α與氧化應(yīng)激造成的損傷關(guān)系極為密切，可以很好地反映機(jī)體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平。相關(guān)研究報(bào)道，機(jī)體氧化應(yīng)激失衡在高血壓、糖尿病等血管病變中發(fā)揮著重要作用，8-iso-PGF2α水平成為國內(nèi)外研究人體脂質(zhì)過氧化的重點(diǎn)內(nèi)容，也是異前列腺素中含量最多、最穩(wěn)定的一種形式，可以正確反映人體的氧化應(yīng)激及自由基誘導(dǎo)之后過氧化情況[6]。8-isoPGF2α是一種具有生物學(xué)活性的前列腺素樣物質(zhì)，這是細(xì)胞生物膜經(jīng)過氧自由基過氧化作用之后的特異性產(chǎn)物，該指標(biāo)能準(zhǔn)確反映缺氧缺血再灌注患者的脂質(zhì)過氧化作用[7]。8-iso-PGF2α的生成不依賴環(huán)氧化酶(COX)，是氧自由基損害脂質(zhì)細(xì)胞膜多不飽和脂肪酸(花生四烯酸)后的產(chǎn)物，其在體內(nèi)的表達(dá)水平不會(huì)因使用阿司匹林等非甾體消炎藥影響COX而發(fā)生改變。因此，8-iso-PGF2α是臨床判斷人體自由基氧化程度及其抗氧化療效最佳的生化指標(biāo)。有研究表明孕婦的外周血8-iso-PGF2α水平上升與病癥的嚴(yán)重 程度呈正相關(guān)[8]。檢查8-iso-PGF2α水平無需過于貴重的儀器，檢測費(fèi)用不高，檢測結(jié)果具有敏感性、準(zhǔn)確性、特異性均較高的特點(diǎn)[18-19]。8-iso-PGF2α水平升高會(huì)增加自閉癥的風(fēng)險(xiǎn)[19-20]。有文獻(xiàn)報(bào)道8-iso-PGF2α與呼吸系統(tǒng)疾病也密切相關(guān)[21]。本研究顯示，對照組孕婦血清8-iso-PGF2α水平在妊娠期間保持穩(wěn)定。GDM患者8-iso-PGF2α顯著升高，并且隨著妊娠進(jìn)程持續(xù)升高。孕中期確診GDM的孕婦在妊娠早期體內(nèi)可能已存在脂質(zhì)過氧化損傷，提示氧化應(yīng)激與GDM的發(fā)病相關(guān)，可能是GDM的發(fā)病機(jī)制之一。

妊娠早期測定TNF-α和8-iso-PGF2α水平可能預(yù)測GDM的發(fā)生，可早期采取干預(yù)措施預(yù)防GDM的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示GDM組患者不僅血清TNF-α和8-iso-PGF2α水平較對照組升高，臍血中的表達(dá)水平也較對照組升高。有研究報(bào)道臍血中的8-iso-PGF2α水平與孕婦血清水平呈正相關(guān)[22]。因此，通過檢測孕婦血清中TNF-α和8-iso-PGF2α水平，有可能幫助早期預(yù)測新生兒體內(nèi)脂質(zhì)過氧化損傷。通過早期檢測孕婦外周血TNF-α和8-iso-PGF2α水平，預(yù)測GDM的發(fā)生，根據(jù)檢測結(jié)果選擇性開展抗氧化治療，可能有利于減少GDM的發(fā)生，或減輕GDM對母親、胎兒及新生兒的不良影響。

綜上所述，GDM孕婦血清TNF-α、8-iso-PGF2α顯著高于正常妊娠孕婦，且TNF-α、8-iso-PGF2α隨著GDM患者妊娠進(jìn)程持續(xù)升高，因此TNF-α、8-iso-PGF2α可以作為GDM檢測診斷的重要指標(biāo)。