酶工程綜合性實驗項目的設計與實踐

黃九九

摘要? ? 酶工程實驗作為生物技術的主要課程之一，具有很強的實用性和應用性。本課程的目的是鍛煉學生運用酶知識和技術解決問題。為此，設計了一個綜合性實驗項目——木瓜蛋白酶酶反應器的設計及應用，將酶的制備、酶學性質分析、酶的修飾固定、酶反應器的設計及應用等知識點進行整合，選取南方特征水果木瓜為實驗對象，包括木瓜蛋白酶的制備、木瓜蛋白酶活力的測定、激活劑對木瓜蛋白酶活力的影響、殼聚糖凝膠顆粒固定化木瓜蛋白酶、酶反應器設計及酪蛋白水解物的制備等6個部分。這項實驗可以培養學生綜合運用酶學知識和實驗技能解決問題的能力。

關鍵詞? ? 酶工程;綜合性實驗;課程建設

中圖分類號? ? G642? ? ? ? 文獻標識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2020）03-0247-04? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

Design? and? Practice? of? Comprehensive? Experiment? Project? of? Enzyme? Engineering

HUANG Jiu-jiu

（College of Life Sciences，South-China of Agricultural University，Guangzhou Guangdong 510642）

Abstract? ? As one of the main courses of Biotechnology，experiment of enzyme engineering has strong practicality and application.The aim of this course is to train students to solve problems with enzyme knowledge and technique.This paper introduced a comprehensive experiment：the design and application of papain enzyme reactor.This project integrated the processes of enzyme preparation，enzyme properties analysis，enzyme modification and immobilization，and the design and application of enzyme reactor，etc.This experiment selectd papaya，a southern characteristic fruit，as the research object.It contained six sections：the preparation of papain，the determination of papain activity，the effect of activator on papain activity，the immobilized papain with chitosan gel particles，the design of enzyme reactor and the preparation of casein hydrolysates.Students′way of thinking and experiment skills in enzyme research can be? fostered by this comprehensive experiment.

Key words? ? enzyme engineering;comprehensive experiment;course construction

現代生物技術是利用各種特定生物系統進行高效而經濟的物質、能量或信號轉化的現代復合技術體系，包括基因工程、蛋白質工程、細胞工程、酶工程和微生物工程等[1]。酶工程指的是在包含細胞、細胞器和酶等元素的特定生物反應器內，利用酶元素特定生物催化活性，將原料催化轉化為目標產物并用于社會生產的一門科學工程技術。

隨著生物技術的發展，特別是酶學研究迅速發展、酶制劑的生產和應用推廣，酶的應用涉及到社會生產的方方面面，因而急缺理論基礎扎實和實踐經驗豐富的人才[2-3]。酶工程實驗課程已成為高等院校生物技術、生物工程、生物制藥、生物科學、食品科學等專業的主干課程，熟練掌握酶工程所涉及的實驗技術對于生物技術人才的培養日顯重要[4-5]。

1? ? 綜合性實驗在酶工程實驗教學中的必要性

酶工程是以實驗為基礎的學科，實驗教學在酶工程教學中的地位不言而喻[6]。實驗教學是提高學生綜合素質能力的關鍵途徑，不僅能進一步鞏固課上所學的理論知識而且能培養學生積極思考及動手能力。

目前，用于高校實驗課堂教學的實驗主要分為基礎性、驗證性實驗和綜合性、設計性實驗兩大類。其中，基礎性、驗證性實驗“教師容易教、學生容易學”，學生只需要按照實驗指導書上的步驟按部就班地完成相關實驗操作即可，而且具有實驗準備簡單、實驗消耗小等特點，因而這類實驗十分受學校、教師、學生的歡迎，其授課學時往往占據了各門類實驗授課的大部分學時。這類實驗有夯實基礎、訓練基本實驗技能的作用，但對于酶工程這類較為專業的課程來說，這樣的設置不僅不利于提高學生分析、解決問題的能力，同時限制了學生的思維，極易產生思維惰性，不利于學生積極獨立思考和主觀能動性的發揮[7]。因此，應增加設計型、綜合型實驗。此類實驗為復合型實驗，由本課程多個知識點綜合而成，特別強調實驗的系統性、連貫性和整體性，是綜合訓練學生技能、提高學生整體認知的主要途徑[8]。

酶工程課程教學的主要內容包括酶的生產、酶的分離純化、酶與細胞的固定化、酶的修飾、酶的催化、酶反應器與酶傳感器、酶基因改造、新酶的開發等內容（圖1），相應的實驗教學內容包括酶源的篩選、酶的分離、酶的純化、酶活測定、酶學性質分析、酶的固定化、酶的化學修飾、酶的應用等。受限于學時安排和實驗教學實施條件，許多高校在實施酶工程實驗教學中選取其中部分單元，并且各個單元分別設計一個獨立實驗進行教學，例如，某大學針對生物工程專業開設的酶工程實驗課的實驗項目中，“酶的生產”用的是淀粉酶，“酶的分離制備和活力測定”用的是大豆脲酶，“酶與細胞的固定化用”的是蛋白酶，“酶的應用”講的又是果膠酶。雖然這樣的實驗項目也基本涵蓋了主要教學內容，但各個實驗之間缺乏關聯性、系統性，學生獲得的知識是單元化、碎片化的，學生修讀完后，對酶工程的教學內容仍然十分迷惑，無法將學到實驗技術活學活用。如果將原本單元化獨立化的實驗進行整合，形成一個綜合性實驗，不僅有利于學生對酶工程知識能有一個全局性的把握，而且能夠使得學生深入理解并掌握內部各個單元實驗的關聯性，進一步發揮酶工程實驗教學在培養應用型、創新型人才方面的作用[9]。

2? ? 綜合性實驗的內容

根據實驗內容的關聯性和多年的教學經驗，圍繞酶工程的主要知識點，選取南方特征水果木瓜為實驗對象，將酶的制備、酶學性質分析、酶的修飾固定、酶反應器的設計及應用等知識點進行整合，行成了綜合性實驗項目——木瓜蛋白酶酶反應器的設計及應用，內容包括木瓜蛋白酶的制備、木瓜蛋白酶活力的測定、激活劑對木瓜蛋白酶活力的影響、殼聚糖凝膠顆粒固定化木瓜蛋白酶、酶反應器設計及酪蛋白水解物的制備等6個部分（圖2）。

2.1? ? 木瓜蛋白酶的制備

實驗操作內容：選取已經謝花坐果達到2個月以上的木瓜并用濕棉布擦拭表面至干凈無痕，采用牙簽在其表面劃出深度達到1～2 mm的劃痕，采用培養皿收集流出的白色汁液，凝固后稱量獲得汁液的重量，將凝固物轉移至研缽中，加入適量濃度為 0.1 mol/L 磷酸鈉緩沖液（pH值7.2）充分研磨，之后按10 000 r/min 轉速離心10 min，獲得上清液體。所得上清即為木瓜蛋白酶粗酶。

涉及的實驗原理和方法：木瓜又名番木瓜（Chaenomeles sinensis），多年生常綠大型草本植物，生長在南、北緯32°之間，為南方常見水果，木瓜汁液中存在著大量的木瓜蛋白酶[10]。通過本實驗讓學生學習和掌握植物酶源的選取、采集和粗酶制備等方面的基本原理和方法。

2.2? ? 木瓜蛋白酶活力測定

實驗操作內容：取上述提取得到的粗酶液0.1 mL，加入1.9 mL激活劑溶液，35 ℃水浴預熱10 min，加入1 mL 1%酪蛋白溶液，混勻，35 ℃水浴反應10 min，加1 mL 10% TCA終止反應，過濾，測定濾液的OD275 nm值，以先加1 mL 10% TCA的樣品為對照，定義在當前測定條件下，使測定體系在 275 nm波長下的吸光度每1 min增加0.01所需的酶量為1個酶活力單位（U）。涉及的實驗原理和方法：酪蛋白是一種蛋白質，它被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光區275 nm處有吸收峰，根據測定275 nm 處的吸收值，可以判定木瓜蛋白酶的酶活力。通過本實驗讓學生學習和掌握蛋白酶的測定方法、原理和酶活力單位的定義方法。

2.3? ? 酶學性質分析

實驗操作內容：在上述酶活測定方法中，其他成分和步驟不變，激活劑中EDTA的濃度依次設置為0、0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L，測定木瓜蛋白酶的活力，以酶活力大小對EDTA濃度作曲線，分析EDTA對木瓜蛋白酶活性的影響;同樣將激活劑中半胱氨酸的濃度依次設為0、5、10、20、40 mmol/L，測定木瓜蛋白酶的活力，以酶活力大小對半胱氨酸濃度作曲線，分析半胱氨酸對木瓜蛋白酶活性的影響。

涉及的實驗原理和方法：木瓜蛋白酶的活性中心含有半胱氨酸，是一種巰基蛋白酶，當位于活性中心的Cys25被氧化劑氧化或與金屬離子結合時，酶的活力被抑制，而還原劑半胱氨酸（或亞硫酸鹽）或EDTA能恢復酶的活力[11]。通過本實驗讓學生了解木瓜蛋白酶的結構特點、酶活測定的影響因素分析，并掌握酶學性質動力學曲線分析的實驗設計和方法。

2.4? ? 酶的固定化

實驗操作內容：準確稱取殼聚糖0.5 g，加入35 mL 1%冰醋酸溶液溶解，隨后加入3.0 mL 37%甲醛混合均勻，水浴40 ℃條件下保溫100 min，獲得透明狀凝膠，加入少量蒸餾水，并將其壓碎，轉移至研缽中研磨成適當大小的顆粒，加入含有100 mL蒸餾水的燒杯中，獲得懸濁液，滴加2 mol/L NaOH溶液將pH值調節至8.0，靜置10 min，抽濾并用蒸餾水洗滌顆粒多次。取上述制得的凝膠顆粒10 g，加入 0.8%戊二醇40 mL，靜置100 min，抽濾并用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH值7.2）洗滌3～4次，除去殘留的戊二醇。將上述凝膠顆粒加入15 mL木瓜蛋白酶液中，在溫度4 ℃下靜置2 h，并多次攪拌分散，并用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH值7.2）洗滌3～4次凝膠顆粒以除去未固定的木瓜蛋白酶（注意：收集洗液不要超過50 mL），即得固定化木瓜蛋白酶。

數據計算方法：依次測定溶液酶活力、殘留酶活力、固定化酶活力，計算固定化酶的活力回收率和相對活力。計算公式如下：

涉及的實驗原理和方法：殼聚糖由甲殼素脫去分子中的乙酰基轉變而成，是一種無毒易得、生物降解性好且相溶性好的天然高分子材料，因而被廣泛用于固定化酶的載體。殼聚糖分子中的D-葡胺糖的氨基-NH2與戊二醛醛基縮合，而戊二醛的另一個醛基與酶的游離氨基縮合，形成殼聚糖-戊二醛-酶結構，得到固定化酶[12-13]。本實驗帶領學生學習以戊二醛為雙功能試劑的載體交聯法固定化木瓜蛋白酶原理和方法，掌握酶的固定化以及固定化效率的評價方法。

2.5? ? 酶反應器的設計

實驗操作內容：按圖3所示連接好各反應器組件，并將上述實驗制備的固定化木瓜蛋白酶裝入玻璃反應柱內。

涉及的實驗原理和方法：酶反應器是酶（包括游離酶、固定化酶或固定化細胞）在體外作為催化劑進行反應時所需的反應容器[14]。酶反應器是酶工藝的中心環節，是原料到產品的紐帶。通過本實驗讓學生學習了解酶反應器的基本原件、設計思路和組裝過程，通過實驗室模擬直觀掌握酶在生產實踐中的應用實例，激發學生學習酶工程、掌握酶工程實驗技術的興趣。

2.6? ? 酪蛋白水解物的制備

實驗操作內容：打開超級循環恒溫水浴裝置，將溫度設定在35 ℃，在取樣瓶中加入反應底物溶液150 mL（酪蛋白和激活劑），并打開恒流泵啟動反應，計時;每隔5 min從取樣瓶中抽取反應樣品，分別測定反應過程中底物的減少和產物的增加以了解反應進程。其中，底物的減少以反應液中蛋白含量的減少來表示，其中蛋白含量的測定用考馬斯亮蘭G-250法，取50 μL的樣品液加入2.5 mL的考馬斯亮蘭G-250溶液，搖勻，在595 nm波長下測定吸光度;產物的增加以反應物中酪氨酸和含酪氨酸的短肽的變化表示，測定方法為取2 mL的反應液加入2 mL 10% TCA混勻，過濾，取濾液測定OD275 nm值。

涉及的實驗原理和方法：蛋白水解物在食品、醫藥和日用化妝品等領域具有廣泛的用途[15]，用蛋白酶水解各類蛋白是較常用的方法，應用酶反應器可以充分利用酶的催化特性，不僅可以降低成本，還可以提高生產效率。通過本實驗讓學生學習和了解酶在生產實踐中的應用，切實體會酶催化反應和固定化的特點和優勢，更加貼近生產應用實踐。

3? ? 綜合性實驗的教學過程

3.1? ? 實驗原理講解

作為一個綜合性實驗，在課程開始講解時要突出“綜合”，首先要把整個實驗的主線“酶的分離—酶活測定—酶學性質分析—酶的固定化—酶反應器的設計—酶的應用（酪蛋白水解物的制備）”展示給學生，讓學生對這個實驗有個總體的把握;其次，綜合性實驗周期相對較長，涉及的知識點較多，對于實驗原理的解釋，可以充分利用“實驗等待”的時間進行，比如有關固定化的知識可以在處理殼聚糖時講解，而酶反應器及應用的講解則可以安排在酶固定化實驗等待過程中進行;再次，綜合性實驗的講解也要有藝術，是啟發式、引導式的講解，而不是填鴨式的“灌”，比如，在介紹木瓜蛋白酶的制備時可以先讓學生回憶接觸木瓜的經歷，在酶反應器的設計時可以先讓學生自己動手，然后結合各人組裝的情況邊糾正邊講解等。讓學生帶著問題想和學，引導學生積極思考、參與討論，鼓勵學生發現問題、分析問題和獨立解決問題。

3.2? ? 課堂實驗操作

實驗教學側重培養的是學生的動手操作能力，讓學生通過實踐操作更好地理解理論知識和運用理論知識解決實際問題。首先，在時間安排上，系統的講解不應超過實驗學時的10%，應留更多的時間讓學生動手操作。其次，綜合性實驗對學生的綜合能力要求更高，實驗過程遇到的問題更多、更復雜，因而實驗過程中組成團隊十分必要。以往的分組往往是按學號順序進行，這樣的分組方式往往達不到教學效果;在實踐過程中發現，最優的組合方式是實驗課前先和學習委員進行溝通，根據以前基礎實驗課的情況（比如上學期實驗課的成績）對學生進行分組，形成一定范圍的互助實驗團隊，以先進帶后進，課堂氛圍活躍，學生圍繞實驗討論積極，學習效果好。

3.3? ? 課后總結提高

獲得了實驗結果后，如何分析總結、在總結中提高十分必要，作為一個綜合性實驗項目更是如此。實驗的總結，往往以實驗報告的形式體現，而以往的實驗報告，學生按照實驗指導書把實驗目的、實驗原理、實驗材料、實驗步驟抄寫一遍，然后附上實驗結果和數據處理即完成，還可以獲得不錯的分數。但是，在綜合性實驗中，這樣的報告是不合格的，不利于學生綜合思維的培養和獨立思考、分析、解決問題能力的提高。總結綜合性實驗實踐的經驗，筆者認為，綜合性實驗的實驗報告應包括實驗背景、實驗步驟、結果分析以及實驗小結等4個部分。比如，本文所介紹的“木瓜蛋白酶酶反應器的設計及應用”實驗項目，其實驗報告應首先圍繞“木瓜蛋白酶、酶的分離純化、酶活力測定、蛋學性質分析、酶的固定化、酶反應器及酶的應用”進行綜述，對這些知識點進行系統的梳理;其次，用學生自己的語言對實驗整體性進行描述，理順實驗間的關系，用流程圖的方式寫出實驗步驟;再次，要針對每一個單元的實驗數據進行處理，并結合其他組以及他人實驗結果進行比較分析，查找實驗存在的問題及改進的關鍵點;最后，總結整理通過這次綜合性實驗的學習掌握的實驗技術和方法以及作為參與者的體會，并提出改進的建議。

3.4? ? 實驗課程考核

綜合性實驗由于課時長、知識涉及面廣，如何對授課學生進行公平合理評價一直是難題[16]。以往的實驗課程考核僅僅以實驗報告的優劣作為評價指標，導致學生不注重實驗過程，片面追求實驗結果的正確性、實驗報告的篇幅和整潔程度，嚴重制約了對學生綜合素質的培養。在實踐過程中，改變傳統的考核方式，鼓勵學生參與評價，建立了更為客觀的實驗成績評價體系（圖4）。學生實驗成績由課堂表現和實驗報告2個部分組成，其中：課堂表現從課堂考勤、實驗參與度、小組配合度3個維度進行評價，實驗報告則從及時性與規范性、數據處理與實驗分析2個方面進行。這樣，既強調了實驗報告的重要性，又突出了學生參與實驗以及團隊協作意識，其公平合理性得到了學生的普遍認同，有利于培養和提高學生的實踐能力和創新能力。

4? ? 結語

“木瓜蛋白酶酶反應器的設計及應用”綜合實驗項目實際上將酶的制備、酶活力測定、酶學性質分析、酶的修飾固定、酶反應器的設計及酶的應用等6個單元的實驗內容有機融合在一起，形成了一個集綜合性和設計性于一體的實驗項目，旨在培養和提高學生綜合利用酶工程知識獨立分析、解決問題的能力和素質。經過多年的實踐，學生普遍反映，通過該實驗的學習，學生實驗的主動性、責任感和參與性增強，獨立分析問題和綜合解決問題的能力得到了有效提高。綜合性實驗項目實施以來，學生對“酶工程實驗”課程的評教成績均在93分以上，綜合評價連續2年位列該專業所有實驗課程的前10%。

5? ? 參考文獻

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