細菌內毒素的致病機制及檢測控制技術

（保定賀陽衡水一中高級中學，河北保定 071000）

0.引言

細菌內毒素（Endotoxin）是革蘭氏陰性菌所特有的、具有生物學活性的物質，它在熱環境下較為穩定，只有在細菌受到外部損傷后才會釋放出來，因而稱為內毒素[1]。其主要成分為脂多糖，具有致熱性、致死性等毒性，人體暴露后有可能出現白細胞減少、血壓降低的情況，嚴重時可能產生施瓦茲曼反應、細胞壞死、休克等現象。所以明確細菌內毒素的潛在健康危害、開發新的毒性控制技術對于人體的生命安全十分重要。本文從以上兩方面出發，對現有危害和控制技術做出綜述。

1.細菌內毒素的致病機制

除直接作用于靶細胞引起致病外，通常情況下，細菌內毒素分子進入體內后，會被生物體內的巨噬細胞吞噬，引發免疫反應，進而誘導巨噬細胞產生多種信號分子，這些信號分子隨內環境在機體內散布出去，并傳遞信息，改變某些正常生理活動，進而導致生物體出現病癥。通常情況下，不同的革蘭氏細菌產生的內毒素表面蛋白質等識別物質的不同，其引發的癥狀也不相同，如：李氏桿菌溶血素導致腦膜腦炎等[2]。

細菌內毒素的作用過程由以下幾步構成：第一步，與細胞膜受體結合；第二步，完成其跨膜的內在化過程，通常細菌毒素的內在化主要依靠吸附或濃縮內吞作用，也叫受體介導的內吞作用（簡稱RME）；第三步，與細胞質中的受體或底物結合，完成其生理活動，誘發病癥[3]。

通常，細菌內毒素和相應效應細胞識別是誘發機體對革蘭氏陰性菌反應的必要條件，目前認為這種識別涉及了血清蛋白、效應細胞及受體等多類物質。大多研究認為細菌內毒素和吞噬細胞的受體識別過程可能不止一種方式。通常內毒素誘導效應細胞產生大量炎癥因子等介質，借助這些介質造成對多器官、系統的破壞以及一系列連鎖炎癥反應及其并發癥[3]。

2.細菌內毒素的檢測技術

目前，細菌內毒素的檢測方法較為多元化，根據其實驗原理、檢測技術主要包括以下3種：

2.1 熱原檢測法

熱原作為一種較為常見的雜質，會污染藥品，嚴重危害藥品安全性。目前，常用具體檢測方法為 RPT和BET。

（1）RPT法。RPT 主要采用靜脈注射家兔耳緣的方式，通過判斷體溫是否升高，也稱家兔熱原試驗法。由于家兔屬于哺乳動物，對熱原的反應與人較為相似，所以廣泛應用于人體細菌內毒素的檢測。RPT對控制藥品的安全性在很長一段時間內起到必不可少的作用，但是存在很多缺點，如：不能定量檢測熱原、需要使用動物實驗、檢測周期長、靈敏度低等，其最大弊端是并不能真實反映人體對熱原的反應機制，因此家兔熱原試驗法正被逐步取代[4]。

（2）BET法。BET也稱為鱟試劑法，鱟試劑可與細菌內毒素特異性結合后顯色，所以可用來檢測細菌內毒素。鱟試劑法是目前檢查細菌內毒素的常用標準，已先后被多國認可。鱟血液的變性細胞通過外力方式破裂后可提取一種可以能夠與內毒素發生特異性凝膠反應的細胞溶解物，進而制備鱟試劑。鱟試劑的具體反應過程如圖1所示：首先內毒素誘導C因子、B因子先后活化，并促使凝固酶生成，催化凝固蛋白原轉化為凝膠，進而進行識別。鱟試劑法操作較為簡單、相關研究較為完善，并且反應靈敏、結果準確，適用于多種不同類別的場合檢測，但該方法在檢測復合藥品時存在很多干擾因素，且與家兔熱原試驗法一樣仍不能反映人體對熱原的反應機制，僅能檢測特定細菌內毒素是否存在。同時，現如今鱟資源逐漸枯竭，生物和醫學界急需能夠很好地取代鱟試劑法的方法[4]。

常用的鱟試驗方法比較如表1所示。

表1 不同鱟試驗方法比較

2.2 微量凝膠法

微量凝膠法與經典凝膠法的操作步驟類似，但其試劑用量只需經典凝膠法的一成左右，能夠極大程度節省鱟試劑，并且由于加樣量很少，所需反應容器和結果判斷方法也較簡單。微量凝膠法的本質是經典凝膠法的一種改良方法，除了用量更精細之外，兩者的反應容器也有較大的不同。微量凝膠法的反應容器為平面，而經典凝膠法（鱟試劑）的反應容器為反應瓶。而且兩者在結果判斷上也存在區別。微量凝膠法需使用染料滴在凝膠樣品上，根據顏色變化判斷凝膠的緊實程度，若凝膠未發生變色，則說明凝膠狀態緊實，顏色物質無法進入內部，只能在表面留存或通過后續步驟被沖洗掉，此時結果可標記為陽性；若凝膠出現變色情況，則結果可標記為陰性。而經典凝膠法（鱟試劑）則需通過旋轉反應瓶判斷凝膠的堅實程度，從而標記陰陽性[5]。

2.3 重組C因子法

C因子是鱟試劑檢測中重要的反應前體物，可以與細菌內毒素發生特定反應，最終產生凝膠，引起濁度或者顏色的變化。所以C因子具有檢測細菌內毒素的潛質。重組C因子是一種人工合成的C因子，兩者功能上存在一定的相似性，均可與細菌內毒素反應，生成熒光物質。熒光物質的產生量與底物含量存在一定的線性關系，可根據熒光強度判斷底物濃度。終點熒光法即是利用該熒光信號的變化確定細菌內毒素含量。近年來，國際上針對重組C因子替代以往對于細菌內毒素的檢查法進行了專門的研究，尤其是資源保護方面。重組C因子法的優點在于反應簡單、特異性強、防干擾性強。

3.細菌內毒素的去除方法

細菌內毒素具有多種特性，比如耐高溫、體量小、易被吸附、不易揮發等物理特性，也具有易溶于水、易與多種物質發生反應的化學特性，但是最明顯的特征便是依附細菌生存。所以去除細菌是去除內毒素最有效的方式，目前常見的除菌方式包括放射照射、濕熱滅菌、干熱滅菌、化學消解等，從源頭上減少細菌內毒素的產生。而且也可以依據物理方法去除內毒素，如利用其易被吸附的特點采用大分子吸附劑可實現去除、依據不同物質沸點的不同采用蒸餾法去除、依據其不耐酸堿的特性采用強酸或強堿去除[6]。

由于內毒素在細菌細胞破裂后才會釋放，所以往往不能通過使用抗生素來達到抗菌的目的，故要使用一些特殊的物質。目前，針對其脂多糖的化學本質，主要有四種方式可以去除細菌內毒素：溶菌酶對蛋白質、脂質等的溶解作用去除內毒素；殺菌通透性增加蛋白；陽離子抗微生物多肽；NK細胞溶素[1]。除此之外，生物學界和醫學界等領域對細菌內毒素的控制技術仍在進行不斷地探索和嘗試。

4.結語

目前細菌內毒素的相關研究還不夠系統、全面，多為針對某類毒素的實驗分析，所以本文就細菌內毒素的致病機制、檢測方法、控制方法進行概括，進一步明晰了不同層級之間的內在聯系和遞進關系，以期為相關研究提供理論參考。細菌內毒素與人體健康和生命安全息息相關，相關的研究方法也有待進一步發展，具有較高的發展前景和應用前景。