高效液相色譜測定抗壞血酸對映體色譜柱選擇

杜瑞 關炳峰 尹紅娜 王珂 孫茜茜 陳世偉

摘要[目的]選擇L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸在高效液相色譜分離中最佳色譜柱。[方法]對比C18柱、HILIC酰胺柱、HILIC聚合物柱、HILIC硅膠柱、氨基柱和氰基柱6種色譜柱填料分析抗壞血酸對映體的分離度和流動相。[結果]HILIC酰胺柱分離度最大，為4.84;其次為氨基柱，分離度為2.80;流動相為0.1%磷酸水和乙腈。[結論]HILIC酰胺柱為分析抗壞血酸對映體的最合適色譜柱填料。

關鍵詞高效液相色譜;L-抗壞血酸;D-異抗壞血酸;色譜柱

中圖分類號O657.7+2文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2020）04-0196-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.04.057

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Determination of Ascorbic Acid Enantiomer Column by High Performance Liquid Chromatography

DU Rui，GUAN Bing-feng，YIN Hong-na et al（Henan Commerce Science Institute Co.，Ltd.，Zhengzhou，Henan 450002）

Abstract[Objective]L-ascorbic acid and D-ascorbic acid were selected as the best chromatographic columns for HPLC separation.[Method]The C18 column，HILIC amide column，HILIC polymer column，HILIC silica column，amino column and cyano column were compared to analyze the ascorbic acid enantiomer resolution and mobile phase.[Result]The highest resolution of the HILIC amide column was 4.84;the second was the amino column with a resolution of 2.80;the mobile phase was 0.1% phosphoric acid water and acetonitrile.[Conclusion]HILIC amide column is the most suitable column packing for the analysis of ascorbic acid enantiomers.

Key wordsHPLC;L-ascorbic acid;D-isoascorbic acid;Chromatographic column

L-抗壞血酸（L-ascorbic acid）又稱維生素C（Vitamin C），學名L-3-氧代蘇己糖醛酸內酯[1]。L-抗壞血酸在人體內不能合成，主要存在于蔬菜和水果中，天然具有抗氧化性質，是一種營養強化劑和食品添加劑，廣泛用于食品加工和保健品行業中[2-3]。D-異抗壞血酸（D-isoascorbic acid）是L-抗壞血酸的對映異構體，與L-抗壞血酸化學性質相似，但生理活性僅有L-抗壞血酸的1/20[4]。D-異抗壞血酸作為食品抗氧化劑和肉制品的防腐助色劑[2，5-6]，但攝入過多會造成白細胞的抗病能力下降，使人體受到傷害[7]。

由于L-抗壞血酸、D-異抗壞血酸生理活性不同，因此對抗壞血酸對映異構體分析十分重要。在手性分析中，常用的分離手段有毛細管電泳法[8-10]和高效液相色譜法[11-15]。毛細管電泳分離方法雖然有很高的手性分析能力，但與HPLC相比柱容量小，造成不宜大體積高濃度進樣;并且在食品安全檢測方面，毛細管電泳沒有高效液相色譜普及率高。筆者采用HPLC法測定抗壞血酸對映體，考察不同色譜填料（C18、HILIC、NH2、CN）對抗壞血酸對映體分離的影響。

1材料與方法

1.1材料與試劑

L-抗壞血酸標準品（阿爾塔科技有限公司）;D-異抗壞血酸標準品（阿爾塔科技有限公司）;偏磷酸、磷酸三鈉、磷酸二氫鉀、磷酸（分析純，阿拉丁試劑）;十六烷基三甲基溴化銨（色譜純，阿拉丁試劑）;甲醇（色譜純，迪馬科技）;乙腈（色譜純，迪馬科技）。偏磷酸溶液（20 g/L）：稱取20 g偏磷酸，溶于水定容至1 000 mL;0.1%磷酸水溶液：吸取磷酸1mL，加一級水定容至1 000 mL。

1.2儀器與設備

Agilent 1290 高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測器（美國安捷倫公司）。Agilent 1260 高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測器（美國安捷倫公司）。色譜柱：Poroshell 120 HILIC，3.0 mm×150mm×2.7 μm（美國安捷倫公司）;Accucore150 酰胺 HILIC，4.6 mm×150 mm×2.6 μm（美國Thermo Scientific公司）;Polyamino-HILIC，4.6 mm×250mm×5 μm（迪馬科技）;ZORBAX Eclipse XDB-CN，4.6 mm×150 mm×5 μm（美國安捷倫公司）;Ultimate XB-NH2，4.6 mm×250 mm×5 μm（月旭科技）;Diamonsil Plus C18，4.6 mm×250mm×5 μm（迪馬科技） 。

1.3方法

1.3.1色譜條件。

色譜柱 C18：流動相A為6.8 g磷酸二氫鉀和0.91 g十六烷基三甲基溴化銨，用水溶解并定容至1 L（用磷酸調pH 至2.5～2.8）;流動相B為100%甲醇;A+B（98+2）。氨基柱、HILIC、氰基柱：流動相A（0.1%磷酸）+B（乙腈）。檢測波長245 nm。

1.3.2標準溶液配制。色譜柱 C18：準確稱取L-抗壞血酸、D-異抗壞血酸0.01 g（精確至0.01 mg），用20 g/L的偏磷酸溶液定容至10 mL。氨基柱、HILIC、氰基柱：準確稱取L-抗壞血酸、D-異抗壞血酸0.01 g（精確至0.01 mg），用0.1%的磷酸水溶液定容至10 mL。

2結果與分析

2.1色譜條件比對

C18色譜柱是實驗室常用色譜柱，采用C18分析抗壞血酸對映體過程中，由于抗壞血酸是多羥基化合物，極性大，在C18色譜柱上不保留;在分析檢測過程中，通常加入表面活性劑（十六烷基三甲基溴化銨）和緩沖鹽（磷酸二氫鉀）來改善色譜行為。HILIC親水作用色譜柱在液相色譜柱中常用來分析強極性和強親水化合物，常用流動相是水和乙腈，并且乙腈相比例高于60%。

從表1可以看出，在抗壞血酸對映體分析過程中，采用反相模式的是C18色譜柱;采用HILIC 模式的是HILIC硅膠柱、HILIC酰胺柱和NH2柱;而HILIC聚合物柱不出峰。HILIC酰胺柱分離度最大，為4.84;而C18色譜柱分離度最小，為2.30。

從圖1可以看出，在不同分離模式下，L-抗壞血酸、D-異抗壞血酸出峰順序發生變化;反相模式下，L-抗壞血酸先出峰，D-異抗壞血酸后出峰;而在HILIC模式條件下，出峰順序相反，D-異抗壞血酸先出峰。這主要是由于在反相模式下，流動相采用98%水相;而HILIC模式條件下，流動相采用75%以上的有機相。

在反相模式下，流動相中加入離子對試劑，在運行過程中容易產生氣泡，導致基線不穩，影響定性和定量;離子試劑會對色譜柱帶來不可逆轉的破壞，影響色譜柱壽命。流動相中加入高濃度緩沖鹽，長時間運行，會造成液相流路中緩沖鹽析出，造成流路堵塞，影響儀器壽命。流動相為高比例水相（98%），常規C18色譜柱長時間使用會造成色譜柱填料“疏水塌陷”，致使色譜柱柱效降低，壽命縮短。因此需要選擇在C18色譜固定相鍵和過親水基團的色譜柱，但會增加實驗室成本。

在HILIC工作條件下，固定相表面會首先建立一個富集水的液體層，待分析物在流動相和親水層之間進行分配，從而實現分離，其中氫鍵作用和偶極矩作用是影響保留強弱的主要因素。HILIC固定相的作用主要是固定水，若固定相帶電荷，則離子靜電作用也會影響化合物在色譜柱保留。對照3種不同類型HILIC（硅膠基質、酰胺基質、聚合物基質）色譜柱，L-抗壞血酸、D-異抗壞血酸的色譜行為差別很大。在HILIC酰胺色譜柱上，抗壞血酸對映體基線分離，且峰型窄而尖;在HILIC硅膠色譜柱上，抗壞血酸對映體基線分離，但響應值很低，且峰型很寬。HILIC聚合物基質色譜柱上，抗壞血酸對映體60 min內不出峰，主要是由于該款色譜柱填料是由乙烯醇多孔聚合顆粒上鍵合氨基官能團，耐堿性強，而試驗條件流動性為酸性。氨基柱在乙腈-水體系中，在高乙腈條件下可以作為HILIC親水作用色譜固定相。

2.2HILIC模式下流動相比例對拆分的影響

HILIC酰胺色譜柱在乙腈條件下獲得很好的分離效果。以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相，如圖2所示，通過增加流動相中乙腈的比例（85%～95%），抗壞血酸對映體分離度增加，但響應值降低。結合抗壞血酸對映體分離度和響應值，HILIC酰胺色譜柱最佳流動相條件為乙腈+0.1%磷酸水（90+10）。

氨基柱在乙腈-水體系下，高乙腈條件下，表現為HILIC模式。試驗發現，乙腈比例在75%～80%，分離度和響應值均滿足色譜分離要求（圖3）。

3結論

從抗壞血酸對映體分離度方面來講，HILIC酰胺柱、氨基柱和C18色譜柱都能實現基線分離，且分離度均大于2。其中HILIC酰胺柱分離度最高，其次為氨基柱。從流動相方面角度，HILIC酰胺柱和氨基柱，流動相為0.1%磷酸水和乙腈，無需添加離子對試劑和高濃度的緩沖鹽，流動相成本更低，前處理簡單，對儀器的損傷更小。因此，在實驗室分析測定抗壞血酸對映體時，可以優先選擇HILIC酰胺柱，其次為氨基柱。

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