胃癌順鉑抵抗相關免疫標記基因的富集分析

汪圣毅，程 彥，李旭升，閆亞飛，張尚鑫，閆 強，李永翔

胃癌在我國高發(fā)，手術是主要治療方法，輔助化療可改善預后[1]，但化療抵抗制約療效，與基因、通路的作用有關[2-3]，免疫標記基因(immunologic signature genes, ISGs)與化療抵抗有關[4]。外周髓磷脂蛋白22(peripheral myelin protein 22，PMP22)增強胃癌順鉑抵抗[3]，是否通過ISGs調(diào)控尚不清楚。常規(guī)富集分析可發(fā)現(xiàn)PMP22相關的化療抵抗通路和基因[2]，但預設差異基因的倍數(shù)和統(tǒng)計P值，不能較為全面地反映整體信息[5]。基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)納入全部的差異基因，具有不預篩組間差異基因的優(yōu)點[6]，可發(fā)現(xiàn)細微變化。為明確ISGs與PMP22相關胃癌順鉑抵抗的關系，用GSEA法分析GSE 94714數(shù)據(jù)集，尋找PMP22下游的ISGs，驗證新發(fā)現(xiàn)ISGs對胃癌總生存的影響，為深入揭示胃癌化療抵抗的機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 表達譜數(shù)據(jù)用基因表達數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus，GEO)的GSE 94714數(shù)據(jù)集，包含6個樣本，3個樣本(GSM2481329～GSM2481331)的胃癌細胞MGC-803進行了PMP22基因敲減，另外3個樣本(GSM2481332～GSM 2481334)的PMP22未行敲減處理。GEO2R分析差異基因，設置分組：PMP22基因敲減3個樣本為A組，未敲減3個樣本為B組，保存所有差異基因至excel表，得到差異基因表。

1.2 芯片數(shù)據(jù)及探針基因名轉(zhuǎn)換下載GSE94714的soft文件，導入excel，復制探針和對應基因名稱(GENE_SYMBOL)，形成新的excel表即芯片數(shù)據(jù)表，探針名稱升序排序。差異基因表中的探針名稱進行相同的升序排序，復制ID、adj.P.Val、logFC共3列到芯片數(shù)據(jù)表，excel數(shù)據(jù)高級篩選，匹配出探針對應的基因名稱，包含差異基因表，形成探針基因名轉(zhuǎn)換表，定位GENE_SYMBOL列的空值，刪除沒有GENE_SYMBOL的所有行，另存為包含GENE_SYMBOL的差異基因表，用于后續(xù)分析。

1.3 差異表達分析包含GENE_SYMBOL的差異基因表，導入在線分析工具(Easy Tools v 2.2 by Chris Lou)中(www.chrislifescience.club:3838/R/AnnoE2)的Volcano Online，繪制火山圖。差異倍數(shù)(fold change, FC)以2為底的對數(shù)(Log2FC或Log FC)分別設置為1、1.5，P值<0.05，計算兩種Log FC條件下，有差異(上調(diào)、下調(diào))和無差異的基因數(shù)目，并計算無差異基因數(shù)目的差值。

1.4GSEA未篩選的所有差異基因，用含GENE_SYMBOL的差異基因表，導入在線工具(www.chrislifescience.club:3838/R/AnnoE2)的GSEA中，列名中分別填寫導入表格中對應各列的名稱，分子標簽數(shù)據(jù)庫(MSigDB，molecular signatures database)中ID選擇c7。標準化富集評分(normalized enrichment score，NES)降序排列，取NES前6位的基因集進一步分析。

1.5 免疫標記基因集的交集基因NES前6位的ISGs條目導入MSigDB(http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/search.jsp)，查詢并下載基因，在線工具分析交集基因(http://bioinformatics.psb.ugent.be/cgi-bin/liste/Venn/)，繪制韋恩圖。

1.6 統(tǒng)計學處理在線工具的R軟件進行統(tǒng)計，富集評分標準化的值(NES)進行排列檢驗(permutation test)，錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)方法判斷NES的統(tǒng)計學意義；組間基因表達差異進行t檢驗；交集基因?qū)隟M-plotter數(shù)據(jù)庫(http://kmplot.com/analysis/)，根據(jù)基因表達水平自動選擇臨界值，分割為高、低表達組，Kaplan-Meier法分析基因表達水平與胃癌患者總生存(overall survival，OS)的關系，Log-rank檢驗比較組間差異，給出風險比(hazard ratio，HR)、95 %的可信區(qū)間(confidence interval，CI)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 差異表達矩陣GEO2R分析共獲取差異基因34 183個，用芯片數(shù)據(jù)表對表達數(shù)據(jù)進行整理，轉(zhuǎn)換基因名，刪除無GENE_SYMBOL的行，獲差異表達基因共29 833個。COUNTIF函數(shù)計算Log FC>0的上調(diào)基因共12 452個，Log FC<0的下調(diào)基因共17 381個。

2.2 差異基因表達差異倍數(shù)的對數(shù)(Log FC)為1時，結(jié)果表格中，COUNTIF函數(shù)計算上調(diào)(UP)、下調(diào)(DOWN)、無差異(NOT)基因數(shù)目，分別為3 819個、3 730個、22 284個；Log FC為1.5時，UP、DOWN、NOT基因數(shù)分別為2 300個、1 492個、26 041個。兩種條件下的火山圖見圖1。兩種條件下，UP、DOWN、NOT基因數(shù)的差值分別為1 519個、2 238個、3 757個。上下調(diào)基因數(shù)目與篩選條件的關系見圖2。

圖1 差異表達基因的火山圖A：Log FC為1，P<0.05的火山圖；B：Log FC為1.5，P<0.05的火山圖

2.3 富集分析MSigDB中的c7作為富集分析的基因集，富集得到條目4 872個，NES降序排序，排序前6的結(jié)果見表1，前6位的條目作GSEA圖，見圖3。

2.4 免疫標記基因集的交集基因NES前6位的ISGs條目導入MSigDB，查詢、下載基因，在線工具分析交集，A、C、D基因集得到的交集基因1個，為線粒體核糖體蛋白L12(mitochondrial ribosomal protein L12，MRPL12)，見圖4a。E、F基因集的交集基因2個：富含脯氨酸蛋白13(proline rich 13，PRR13)、富含嘌呤元素結(jié)合蛋白A(purine rich element binding protein A，PURA)；A、E的交集基因5個：艾杜糖2-硫酸酯酶(iduronate 2-sulfatase，IDS)、LIM結(jié)構(gòu)域2(LIM domain containing 2，LIMD2)、小視覺葉同源物(small optic lobes homolog，SOLH)、CCR4-非轉(zhuǎn)錄復合物亞單位3(CCR 4-NOT transcription complex subunit 3，CNOT3)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor beta 1，TGFβ1)；A、F的交集基因4個：毛狀蛋白樣F-肌動蛋白結(jié)合蛋白1(coactosin like F-actin binding protein 1，COTL1)、聚(RC)結(jié)合蛋白1(poly(rC) binding protein 1，PCBP1)、二酰甘油激酶ζ(diacylglycerol kinase zeta，DGKZ)、接頭蛋白2(docking protein 2，DOK2)，見圖4b。

表1 基因集富集分析NES前6的條目

圖2 上調(diào)和下調(diào)基因數(shù)與篩選條件的關系

圖3 前6位免疫標記相關條目的GSEAA～F：對應表1中條目編碼

2.5 相關基因?qū)ξ赴┛偵娴挠绊懮鲜?2個交集基因，導入KM-plotter，分析發(fā)現(xiàn)：MRPL12、PRR13、COTL1、PCBP1的高表達與胃癌OS延長關聯(lián)(P<0.05)，IDS、LIMD2、PURA、SOLH、CNOT3、TGFB1、DGKZ、DOK2的高表達與胃癌OS降低關聯(lián)(P<0.05)，見表2，部分基因的生存曲線見圖5。

3 討論

胃癌的綜合治療可提高療效，作為綜合治療重要組成的化療，在胃癌手術前后的輔助治療中發(fā)揮重要作用，明確化療耐藥機制、降低化療抵抗、提高化療敏感性，具有重要的臨床意義。順鉑通過多種機制抑制胃癌細胞，其耐藥性的產(chǎn)生可由PMP22介導，但其下游是否與ISGs存在關聯(lián)，尚無文獻報道。為探索PMP22下調(diào)后減弱胃癌順鉑抵抗是否通過下游的ISGs發(fā)揮作用，本研究對GEO數(shù)據(jù)庫的GSE94714數(shù)據(jù)集進行了GSEA分析，發(fā)現(xiàn)PMP22可通過多種ISGs相關的下游機制，對胃癌順鉑抵抗的表型進行調(diào)節(jié)。

圖4 交集基因韋恩圖a：基因集A、C、D的交集；b：基因集A、E、F的交集

表2 交集基因與胃癌總生存的關系

本研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)差異倍數(shù)(fold change, FC)和統(tǒng)計P值進行篩選，PMP22基因敲減、未敲減組差異表達基因的數(shù)目減少，因此采用未篩選的差異基因，GSEA分析發(fā)現(xiàn)了NES前6位的ISGs條目，其組成基因用韋恩圖方法取交集，發(fā)現(xiàn)了12個ISGs，均與胃癌的總生存(OS)有關。

隨著差異倍數(shù)FC或logFC的增大，統(tǒng)計分析無差異的基因數(shù)逐漸增加，被排除的基因增多，篩選出有差異的基因數(shù)目逐漸減少，即上下調(diào)基因的數(shù)目均減少，與Xiao et al[7]進行條件篩選后、使組間差異表達基因數(shù)減少的研究結(jié)果一致。預篩選可遺漏部分基因，造成后續(xù)分析無法找到有意義、但是改變細微的重要基因。GSEA方法可避免遺漏，較為全面地分析差異基因，通過預定義基因集，可獲取有分類的基因標記信息。筆者通過GSEA分析獲得的12個基因，既與免疫有關，又與胃癌的預后有關，并且在前期進行的常規(guī)富集分析中未能被發(fā)現(xiàn)[2]，表明GSEA方法是常規(guī)富集分析方法的重要補充。

圖5 部分交集基因?qū)ξ赴㎡S的影響A：MRPL12高、低組的OS生存曲線；B：PRR13高、低組的OS生存曲線；C：IDS高、低組的OS生存曲線；D：LIMD2高、低組的OS生存曲線

新發(fā)現(xiàn)的ISGs通過不同機制參與腫瘤細胞的化療抵抗和發(fā)生發(fā)展，部分基因與胃癌化療抵抗的關系尚未見文獻報道。MRPL12基因可通過改變線粒體代謝、調(diào)節(jié)細胞的氧耗量，影響腫瘤生長，MRPL12敲減后，胰腺腫瘤細胞內(nèi)的線粒體活性降低，糖酵解加強，腫瘤細胞體外生長減慢，但體內(nèi)生長加速[8]。本研究顯示PRR13高表達胃癌的OS延長，但Pontikakis et al[9]發(fā)現(xiàn)卡鉑、紫杉醇治療后，PRR13高表達卵巢上皮性癌的OS縮短，與化療抵抗有關，表明PRR13表達對不同腫瘤生存時間的作用存在差異，其機制有待進一步闡明。COTL1基因可增強乳腺癌對化療的敏感性，與白細胞介素24、非經(jīng)典TGFβ1通路有關[10]。PCBP1可降低豆莢蛋白表達、增強胃癌腹膜轉(zhuǎn)移細胞對多西他賽的敏感性[11]。LIMD2與甲狀腺乳頭狀癌的轉(zhuǎn)移有關[12]。TGFβ1可能通過細胞黏附、轉(zhuǎn)移相關分子通路影響胃癌預后[13]，本研究結(jié)果與之相似。DGKZ作為關鍵基因，與非小細胞肺癌的進展和預后有關[14]。上調(diào)因啟動子甲基化而沉默的DOK2表達，可增強卵巢癌對鉑類藥物的敏性[15]。IDS、PURA、SOLH、CNOT3與胃癌化療抵抗的關系，目前尚未見文獻報道，是進一步研究的方向。

本研究的局限性：新發(fā)現(xiàn)的ISGs與胃癌順鉑抵抗的關系尚需進一步的體內(nèi)外實驗驗證，其作用方向和機制依然存在不確定性，初步結(jié)果僅為繼續(xù)研究的基礎和線索。