川崎病并發感染患兒Treg/Th17細胞、免疫功能的變化及臨床意義

饒曉紅 童文娟 陳丁丁

[摘要] 目的 探究川崎病（KD）并發感染患兒Treg/Th17細胞、免疫功能的變化及臨床意義。 方法 選取2016年1月～2018年6月于安徽省兒童醫院就診的KD并發感染患兒100例作為觀察組，選擇同期診斷為KD但無并發感染患兒37例作為對照組。利用酶聯免疫吸附法檢測兩組患兒炎癥因子指標，采用流式細胞術檢測調節性T細胞（Treg）、輔助性T細胞17（Th17）、CD3+、CD4+、CD8+以及自然殺傷（NK）細胞比例變化，同時利用免疫比濁法測定免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白G（IgG）及免疫球蛋白A（IgA）。 結果 觀察組白細胞個數、血小板計數（PLT）、降鈣素原、中性粒細胞百分比數、超敏C反應蛋白（hs-CRP）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）及白細胞介素8（IL-8）含量明顯均高于對照組（P < 0.05）;流式細胞術結果示，觀察組Treg、Th17細胞百分比及Treg/Th17比值明顯高于對照組（P < 0.05）;免疫比濁法與流式細胞術結果示，觀察組IgG、IgA、IgM、CD4+、NK細胞含量明顯高于對照組（P < 0.05），而CD3+、CD8+及CD4+/CD8+含量明顯低于對照組（P < 0.05）。 結論 KD并發感染患兒炎癥較為強烈，Treg/Th17細胞、免疫功能更為紊亂，這些指標變化對于臨床診斷KD并發感染患兒具有指導意義。

[關鍵詞] 川崎病;并發感染;Treg/Th17細胞;免疫功能;變化;臨床意義

[中圖分類號] R725.4? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）02（b）-0091-04

Changes and clinical significance of Treg/Th17 cells and immune function in children with Kawasaki disease complicated with infection

RAO Xiaohong? ?TONG Wenjuan? CHEN Dingding

Department of Emergency Internal Medicine， Anhui Provincial Children′s Hospital， Anhui Province， Hefei? ?230051， China

[Abstract] Objective To investigate the changes and clinical significance of Treg/Th17 cells and immune function in children with Kawasaki disease （KD） complicated with infection. Methods From January 2016 to June 2018， 100 children with KD complicated with infection in Anhui Provincial Children′s Hospital were selected as observation group， and 37 children diagnosed as KD but not complicated with infection were selected as control group. The inflammatory factors indexes were measured by enzyme linked immunosorbent assay kit and regulatory T cells （Treg）， helper T cells 17（Th17）， CD3+， CD4+， CD8+ and the proportion of natural killer （NK） cells were detected by flow cytometry. At the same time， immunoglobulin M（IgM）， immunoglobulin G（IgG） and immunoglobulin A（IgA） were determined by immunoturbidimetry. Results The number of leukocytes， platelets， calcitonin， percentage of central granulocytes， hypersensitive C-reactive protein （hs-CRP）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-6 （IL-6） and interleukin-8 （IL-8） in the observation group were significantly higher than the control group （P < 0.05）. The results of flow cytometry showed that the percentage of Treg， Th17 cells and the ratio of Treg/Th17 in the observation group were significantly higher than the control group （P < 0.05）. The results of immunoturbidimetry and flow cytometry showed that the contents of IgG， IgA， IgM， CD4+ and NK cells in the observation group were significantly higher than the control group （P < 0.05）， while the contents of CD3+， CD8+ and CD4+/CD8+ were significantly lower than the control group （P < 0.05）. Conclusion The inflammation of children with KD complicated with infection is strong， Treg/Th17 cells and immune function are more disordered. The changes of these indexes have guiding significance for the clinical diagnosis of KD complicated with infection.

[Key words] Kawasaki disease; Complicated with infection; Treg/Th17 cells; Immune function; Change; Clinical significance

川崎病（KD）又名皮膚黏膜淋巴綜合征，是一種全身性血管炎癥病變綜合征，多發于5歲以下兒童，近年來，該病發病率呈現逐年增高的趨勢[1]。KD發病較為復雜，冠狀動脈損傷是KD患兒較為常見的并發癥，嚴重者可能導致心源性猝死。目前KD是兒童獲得性心臟病的主要原因[2]，其導致兒童發生心血管病變的概率高居首位，但是其發病機制至今尚未明確闡明[3]。目前有研究猜測，免疫系統功能紊亂與KD發生、發展密切相關[4]，CD4+CD25+調節性T細胞（Treg）、輔助性T細胞17（Th17）是組成細胞免疫的重要部分，Treg能夠明顯抑制炎性反應，而Th17則能夠不斷促進炎性反應，Treg/Th17比例的變化能夠體現出T細胞免疫功能的變化[5]。KD患兒發病常常伴有EB病毒、肺炎支原體等并發感染，KD患兒并發感染常伴有多種免疫功能改變與紊亂[6-7]。本文對KD并發感染患兒Treg/Th17細胞、免疫功能的變化進行探究，具體研究如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月～2018年6月于安徽省兒童醫院（以下簡稱“我院”）就診的患兒，納入標準：①符合《川崎病診斷指南》[8];②經病原學檢測確診為病毒感染;③年齡4個月～14歲;④治療前未使用影響免疫系統功能類藥物;⑤患者及其家屬同意參與本研究，并簽署知情同意書。排除標準：①患有其他免疫系統疾病;②合并有嚴重心腎疾病;③不配合治療者。觀察組患兒100例，其中男70例，女30例;年齡4個月～8歲，平均（1.76±1.31）歲;并發肺炎鏈球菌感染38例，EB病毒感染27例，衣原體感染10例，沙門菌感染11例，其他病毒感染14例。選擇同期于我院診斷為KD但無并發癥感染患者37例作為對照組，其中男22例，女15例;年齡5個月～6歲，平均（1.99±1.42）歲。兩組性別、年齡比較差異無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。本研究通過我院醫學倫理委員會審核批準。

1.2 觀察指標及檢測方法

1.2.1 炎癥因子檢測? 兩組患兒入院后確診KD后予丙種球蛋白及對癥治療，如存在感染，給予相應抗生素或抗病毒藥物治療。治療前，清晨空腹狀態下收集兩組患兒的靜脈血，檢測白細胞計數、血小板計數（PLT）、降鈣素原、中性粒細胞百分比、紅細胞沉降率（ESR）以及超敏C反應蛋白（hs-CRP）水平變化。同時取200 μL血液，4000 g離心10 min后取血清，離心半徑為11.5 cm，利用酶聯免疫吸附實驗試劑盒檢測兩組患兒血清中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）以及白細胞介素8（IL-8）水平，操作嚴格按照說明書進行（上海通蔚生物科技有限公司，生產批號：20151207）。

1.2.2 Treg/Th17比例檢測? 患兒在空腹狀態下，抽取5 mL靜脈血，并將其儲存于肝素抗凝真空采血管中，放置于-80℃冰箱保存。Treg檢測：取100 μL全血，加入20 μL APC抗人CD25抗體和FITC抗人CD4抗體[英濰捷基（上海）貿易有限公司，生產批號：20150416、20150622]，混合均勻后避光反應10 min，將反應的混合液利用離心機2500 g離心5 min，離心半徑為11.5 cm，將上清液棄掉后加入500 μL的PBS緩沖液，震蕩混合均勻，再次按照2500 g轉速離心5 min后進行固定穿孔，使用Foxp3抗體過夜孵育，進行標記。Th17檢測：將采集的靜脈血按照4000 g轉速離心5 min，離心半徑為11.5 cm，分離出外周血單個核細胞，選取1×107個外周血單個核細胞將其培養于24孔板中，往其中添加50 ng/mL的聚丙烯酸甲酯（PMA）、10 mg/mL布雷非德菌素A以及1 mmol/L的離子霉素（美國Sigma公司，生產批號：20141125、20150217、20151026），將上述樣品混合均勻后，共同培養在含10%加熱滅火小牛血清的RPMI-1640培養基[英濰捷基（上海）貿易有限公司，生產批號：20151027]中，進行共同刺激，培養5 h后，利用FITC抗-CD4抗體進行標記20 min后進行穿孔、固定，之后再使用PE-抗人IL-17A抗體[英濰捷基（上海）貿易有限公司，生產批號：20150613]在胞內進行標記。流式細胞術采用型號為Epics XL-MCL的流式細胞儀（美國貝格曼公司），激發光波長大小為488 nm。

1.2.3 免疫功能指標檢測? 免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白G（IgG）及免疫球蛋白A（IgA）檢測：清晨患兒空腹狀態下抽取靜脈血2 mL，利用免疫比濁法進行檢測，檢測儀器為BNProspec型全自動蛋白分析儀（德國西門子公司），嚴格遵照儀器操作說明進行，儀器所用試劑為儀器配套原裝試劑。免疫細胞檢測：利用流式細胞術檢測CD3+、CD4+、CD8+以及自然殺傷（NK）細胞，具體操作同“1.2.2”。

1.3 統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗;計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患兒炎癥因子比較

觀察組白細胞個數、PLT、降鈣素原、中性粒細胞百分比數、hs-CRP、TNF-α、IL-6及IL-8含量明顯高于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）;兩組ESR差異無統計學意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 兩組患兒Treg/Th17比較

觀察組Treg、Th17細胞百分比及Treg/Th17比值明顯高于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表2。

2.3 兩組患兒免疫功能指標比較

觀察組IgG、IgA、IgM、CD4+、NK細胞含量明顯高于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05），而CD3+、CD8+及CD4+/CD8+含量觀察組明顯低于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表3。

3 討論

KD是一種多發于5～6歲兒童異常免疫反應產生的全身血管性炎癥，并且男孩發病率遠高于女孩[1]。KD發病常伴隨冠狀動脈瘤、冠狀動脈擴張等多種并發癥，嚴重者可能導致心力衰竭、心肌梗死的發生[3]。KD嚴重影響到嬰幼兒的生命安全，但是其病因和發病機制至今尚未闡明，該病尚未有明確診斷手段與特異性的生物標志物，對于患兒早期疾病的診斷與治療帶來一定的困難。研究表明，兒童的這種異常免疫反應可能與T細胞的異常啟動密切相關[9]。Treg細胞是一類具有免疫抑制功能的T細胞亞群，能夠將自身免疫耐受維持在某個水平，抑制自身免疫，在自身免疫疾病的發生、發展等過程中發揮著重要作用[10]。Th17細胞是一類CD4+輔助性T細胞亞群，其在自身免疫反應中起到促進炎癥因子的作用[11]，目前Treg/Th17細胞在誘導多種免疫疾病發生、發展過程中起到重要作用，其比例的變化在某些程度上能夠指示疾病的進程[12]。

本研究結果顯示觀察組炎癥因子各項指標高于對照組，提示KD并發感染對患兒機體免疫傷害更大，釋放大量炎癥因子。機體內TNF-α大量出現，誘導表達血管內皮細胞，使細胞與細胞之間的黏附分子大量增加，對血管內壁造成較大的免疫損傷[13];IL-6和IL-8能夠增強免疫反應，導致患兒血管炎癥的出現[14]。白細胞個數、PLT、中性粒細胞百分比數、hs-CRP是兒科檢測感染的主要指標[15]，降鈣素原能夠早期明確檢測出患兒并發的感染和非感染性疾病，還有助于判斷患兒疾病的預后狀況，幫助醫生調整抗生素的治療方法[16]。陳璐[17]的研究結果與本研究結果相似，提示KD并發感染患兒C反應蛋白、中性粒細胞數均高于未感染組，并且感染組患兒冠狀動脈傷害較大。本研究結果顯示，觀察組Treg、Th17細胞百分比及Treg/Th17比值明顯高于對照組，提示患兒機體內存在Treg/Th17的平衡與失衡，KD并發感染過程中Treg、Th17在患兒體內相互作用、相互調節。Treg和Th17細胞之間的平衡性是自身免疫疾病、神經系統性炎性反應等多種疾病的起因，Th17細胞能夠分泌釋放大量的白細胞介素-17（IL-17），進而導致下游釋放大量的炎癥因子，造成組織器官的損傷，起到促炎的作用[11]，而Treg細胞則通過一系列的直接或間接作用，起到抑炎的作用[10]，本研究中觀察組Treg/Th17比例明顯升高，說明Treg與Th17參與了KD的發生，并且兩者與炎癥因子的變化密切相關。本研究結果發現，觀察組IgG、IgA、IgM、CD4+、NK細胞含量明顯升高，而CD3+、CD8+及CD4+/CD8+含量明顯降低，提示KD并發感染與體液免疫與細胞免疫密切相關。IgG、IgA、IgM等免疫球蛋白是體液免疫的重要免疫分子，在初級免疫反應中起著重要作用[18]，其能夠形成抗體，參與機體的免疫調節。CD4+能夠促進細胞免疫與體液免疫，而CD8+則能夠明顯抑制該過程，CD4+/CD8+比值變化會導致細胞免疫失調，出現病理反應，CD4+與CD8+的平衡在自身免疫中也起到重要作用。孟慶祝等[19]研究表明KD感染肺炎支原體后細胞免疫與體液免疫發生紊亂，與本研究結果相似。KD合并感染患兒T細胞功能異常，T細胞被高活化后導致釋放大量淋巴因子，淋巴因子進一步誘導B細胞分泌免疫球蛋白及其他的細胞因子，對血管造成炎性損傷。B細胞被活化后形成的抗體，對機體免疫起到調節作用，激活后的B細胞能夠發揮更強的免疫效應，更快地殺滅病原菌[20]。對細胞免疫與體液免疫相關因子的檢測，分析其變化對于KD合并感染患兒治療具有積極刺進作用。

綜上所述，KD并發感染患兒體液免疫與細胞免疫更加紊亂，炎癥因子反應更加強烈，兩者可能參與KD的病理過程。對患兒體液免疫、細胞免疫及炎癥相關因子的檢測，有助于患兒的早期診斷與治療。

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（收稿日期：2019-11-06? 本文編輯：任? ?念）