CRIF1對棕櫚酸誘導心肌細胞凋亡的作用及機制*

馮 娟， 侯娟妮， 馮 健， 唐名揚， 宋志平， 陳 莎， 裴海峰△， 楊永健, △

[1陸軍軍醫大學(第三軍醫大學)研究生院， 重慶 400038； 2西部戰區總醫院心內科， 四川 成都 610083]

脂毒性心肌病是指心肌細胞對脂肪酸(fatty acids，FAs)的攝取、代謝和氧化失衡導致毒性脂代謝產物積聚，造成心肌細胞結構和功能受損、心臟功能障礙和心力衰竭等[1]。CR6相互作用因子1(CR6-interacting factor 1，CRIF1)是一種多功能蛋白，表達于細胞核和胞質中，在細胞核中發現具有調控細胞周期和腫瘤發展的作用[2]，并與多種轉錄因子相互作用[3]；它還是線粒體DNA編碼氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPHOS)亞基重要的有絲分裂核糖體蛋白，CRIF1缺失會影響OXPHOS復合物的正常形成，導致線粒體功能降低[4]。有研究表明，CRIF1缺失導致進行性心臟肥大、心力衰竭，甚至死亡[5]。CRIF1是影響心肌細胞線粒體的結構和功能重要分子，而線粒體又是細胞內脂肪酸β氧化的重要場所，因此，CRIF1可能與脂肪酸的代謝及脂毒性心肌病的發生發展有著密切聯系。目前， CRIF1在脂毒性心肌病中的作用及機制尚無研究報道。本研究采用棕櫚酸(palmitic acid, PA)模擬高脂環境誘導心肌細胞凋亡，建立脂毒性心肌病細胞模型，研究CRIF1對高脂誘導心肌細胞凋亡的作用及機制，旨在為脂毒性心肌病提供新的治療靶點。

材 料 和 方 法

1 細胞株

小鼠心肌細胞系(mouse cardiomyocytes，MCMs)購于深圳豪地華拓公司, 產品批號：HTX2799。

2 主要試劑

DMEM培養基及胰蛋白酶(HyClone)；胎牛血清(Gibco)；棕櫚酸(Sigma)；Trizol、SYBR及逆轉錄試劑盒(TaKaRa)；RT-qPCR引物(成都擎科梓熙生物公司)；Lipofectamine 2000、Scra siRNA及CRIF1 siRNA(廣州銳博公司)；抗α-橫紋肌肌動蛋白(α-sarcomeric actin)抗體(武漢博士德公司)；抗CRIF1抗體(Omnimabs)；抗β-actin抗體及山羊抗兔 II 抗(上海優寧維公司)；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(BD)；測定小鼠活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的ELISA試劑盒(ELIXIR)；超氧化物陰離子熒光探針二氫乙啶(dihydroethidium，DHE)和N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)購自上海碧云天公司。

3 主要方法

3.1細胞培養及分組 小鼠心肌細胞培養于含有10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM正常葡萄糖培養基(葡萄糖5.5 mmol/L)中，置于37 ℃、5% CO2培養箱。根據前期預實驗選擇最佳棕櫚酸干預濃度為300 μmol/L模擬高脂環境，建立細胞脂毒性模型，干預時間24 h。首先將MCMs分為對照(control)組和PA (300 μmol/L)組。為探索CRIF1對棕櫚酸誘導MCMs損傷的影響及機制，利用siRNA轉染敲減細胞CRIF1的表達，進一步將PA組分為溶劑組(vehicle，轉染試劑)、非特異陰性siRNA組(Scra siRNA，轉染試劑+非特異陰性siRNA)和CRIF1特異性siRNA組(CRIF1 siRNA，轉染試劑+CRIF1特異性siRNA)。為進一步驗證CRIF1在棕櫚酸導致MCMs損傷的具體機制，利用siRNA敲減CRIF1的表達，再將細胞分為DMSO組和NAC組，并給予相同條件的棕櫚酸干預。

3.2RT-qPCR檢測CRIF1的mRNA表達 采用TRIzol法提取細胞總RNA，測定RNA濃度，逆轉錄為cDNA，以β-actin為內參照，采用RT-qPCR法測量CRIF1的mRNA表達量。用基因相對定量法(2-ΔΔCt)計算目的基因表達量。β-actin的上游引物序列為5’-ACCCCGTGCTGCTGACCGAG-3’，下游引物序列為5’-TCCCGGCCAGCCAGGTCCA-3’；CRIF1的上游引物序列為5’-ACGAATTGCTGCTATGGCCT-3’，下游引物序列為 5’-CATGGCCTAGTGTCCAGGTG -3’。

3.3Western blot 檢測CRIF1蛋白表達 配制分離膠和濃縮膠，取10 μL樣品行SDS-PAGE分離，然后轉至PVDF膜上，于5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h。用抗CRIF1(1∶500)和β-actin(1∶5 000)的 I 抗4 ℃孵育過夜。TBST漂洗3次，II 抗(山羊抗兔，1∶8 000)室溫孵育1 h后，TBST漂洗3次,每次10 min(在搖床上進行)，最后使用ECL化學發光液進行發光，并使用ImageJ軟件分析灰度值。

3.4細胞免疫熒光染色 細胞干預完成后吸去培養基，用PBS沖洗3次,每次5 min。以4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS沖洗(3次)。0.2% Triton X-100透化2～5 min，PBS沖洗。5 % BSA室溫封閉30 min，PBS沖洗。加入抗CRIF1抗體(1∶100)4 ℃過夜，PBS沖洗。加入熒光 II 抗，37 ℃避光孵育30 min，PBS沖洗。DAPI以1:500濃度滴于激光共聚焦皿，室溫孵育5 min，PBS沖洗。保持濕潤，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

3.5CRIF1 siRNA的轉染 提前 1 d 將MCMs接種到6孔板中，待細胞密度到30%～50%時，使用Lipofectamine 2000轉染siRNA，轉染濃度為50 nmol/L，每組設3個復孔。Control組僅給予Lipofectamine 2000處理，Scra siRNA組給予Lipofectamine 2000+Scra siRNA處理，CRIF1 siRNA組給予Lipofectamine 2000+CRIF1 siRNA處理。轉染48 h后檢測CRIF1的mRNA表達水平，72 h后檢測CRIF1蛋白表達以明確敲減效率。轉染48 h后給予300 μmol/L棕櫚酸繼續干預24 h并檢測細胞的ROS和凋亡水平。

3.6流式細胞術檢測MCMs的凋亡水平 用0.25%不含EDTA的胰酶消化離心收集細胞，用預冷PBS洗滌后binding buffer重懸細胞，加入annexin V-FITC(2.5 μL)混勻后，室溫避光孵育15 min，流式細胞術檢測前5 min再加入PI染液(2.5 μL)，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡，FlowJo軟件分析數據。

3.7DHE染色觀察MCMs中ROS的生成 將DHE熒光探針按5 μmol/L濃度用培養基稀釋后加入到各組細胞培養基中，每個實驗組設置3個復孔，37 ℃避光孵育30 min，采用激光共聚焦顯微鏡觀察DHE熒光水平。

3.8ELISA試劑盒測定MCMs細胞內ROS的含量 加入裂解液破壞細胞，4 ℃ 2500 r/min離心30 min取上清液，按試劑盒說明書操作，測量吸光度，計算ROS含量。

4 統計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 高脂促進MCMs中CRIF1的表達

經免疫熒光染色鑒定MCMs,見圖1。采用300 μmol/L棕櫚酸對MCMs干預24 h后，通過RT-qPCR及Western blot法分別檢測，結果發現CRIF1的mRNA和蛋白表達水平均明顯升高(P<0.05)，見圖2A、B。通過細胞免疫熒光染色檢測發現CRIF1的表達水平明顯升高，見圖2C。這提示CRIF1不但在MCMs有表達，而且棕櫚酸可導致其表達增多。該結果表明CRIF1可能在高脂所致的MCMs損傷中發揮了一定作用。

2 CRIF1沉默加重高脂條件下的MCMs凋亡

為驗證CRIF1是否在高脂誘導的MCMs凋亡中發揮了重要作用，本實驗采用特異性siRNA敲減CRIF1的表達后繼續予以棕櫚酸干預。轉染后CRIF1的mRNA及蛋白表達水平均明顯降低(P<0.05)，見圖3A、B。通過流式細胞術檢測發現棕櫚酸能夠導致MCMs凋亡增加(P<0.05)；而CRIF1沉默進一步增加了MCMs凋亡(P<0.05)，見圖3C。該結果表明CRIF1可能是高脂環境下受損MCMs重要的保護性分子。

Figure 1.The identification of cardiomyocytes. The protein expression of α-sarcomeric actin detected by immunofluorescence staining (blue indicates DAPI; red indicates α-sarcomeric actin; ×200).

圖1 心肌細胞鑒定

3 CRIF1沉默誘發心肌脂毒性損傷時增加ROS的生成

為進一步明確CRIF1沉默是否通過氧化應激途徑加重高脂條件下的心肌脂毒性損傷，在敲減CRIF1表達的基礎上予以棕櫚酸干預24 h后，DHE染色和ELISA檢測結果顯示，棕櫚酸能夠增加細胞內ROS 的生成(P<0.05)；而CRIF1沉默后細胞內ROS 的生成進一步增加(P<0.05)，見圖4。這一結果表明CRIF1的確通過抑制ROS的產生發揮高脂條件下的心肌保護作用。

4 NAC部分逆轉CRIF1下調造成的心肌脂毒性損傷

同樣轉染CRIF1 siRNA的細胞，用抗氧化劑NAC(5 mmol/L)干預6 h后，ELISA及流式細胞術檢測結果顯示，MCMs中ROS及細胞凋亡水平明顯降低(P<0.05)，見圖5。這表明CRIF1作用的發揮與氧化應激反應顯著相關。

討 論

近年來，由于人們飲食習慣和生活方式的改變，肥胖的發病率正在逐年增加，肥胖相關的心功能障礙也在逐年升高，這可能與脂毒性心肌病的發生密切相關[6]。心臟能量代謝的60%～80%依賴于脂肪酸的氧化，當心肌細胞對脂質的攝取和氧化失衡時，毒性的脂肪代謝產物(如神經酰胺、二酰甘油和長鏈酰基輔酶A等)可在心肌細胞中積聚引起線粒體功能障礙、能量生成減少和內質網應激等，最終可導致心肌細胞凋亡、心功能障礙和心力衰竭等嚴重后果，這一過程稱為脂毒性心肌病[7]。2型糖尿病、肥胖、心肌缺血和心力衰竭等疾病均可引起脂毒性心肌病的發生[8]。2型糖尿病及肥胖患者的血脂異常可導致心臟脂質積累[9]，而循環中高游離脂肪酸(free fatty acids， FFAs)水平與心肌脂毒性密切相關[10]，可引起心肌肥厚、纖維化和心肌細胞凋亡等[11]。本研究也證實了棕櫚酸能夠誘導心肌細胞凋亡，但其潛在的機制尚不清楚。因此，深入研究脂毒性心肌病的損傷機制和干預靶點非常有意義。

Figure 2.The effect of palmitic acid (PA) on CRIF1 expression at mRNA and protein levels in the MCMs. A: the mRNA expression of CRIF1 detected by RT-qPCR; B: the protein expression of CRIF1 detected by Western blot; C: the protein expression of CRIF1 detected by immunofluorescence staining (blue indicates DAPI; green indicates CRIF1; ×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2 棕櫚酸對MCMs CRIF1表達的影響

線粒體對能量穩態的維持至關重要,其氧化磷酸化系統在細胞能量和自由基的產生中發揮重要作用[12]。線粒體氧化磷酸化系統由嵌入線粒體內膜的5個OXPHOS多聚體復合物組成；而CRIF1是OXPHOS亞基生成所必需的核糖體因子，在維持線粒體的結構和功能中占據舉足輕重的地位[4]。CRIF1是一種具有多種生物學功能的蛋白，在細胞核和線粒體中均有表達，最初被認為是調節細胞周期和生長的分子[13]，可與多種核受體交互作用[14]。在小鼠心肌細胞中，CRIF1的缺失可引起線粒體結構異常和心肌ATP產量降低，表明CRIF1可能在維持心肌線粒體結構和功能中發揮關鍵作用[5]。然而，CRIF1在脂毒性心肌損傷中的表達以及功能研究尚無報道。我們的研究發現，CRIF1表達于MCMs中，且在棕櫚酸干預后明顯上升，提示CRIF1可能在脂毒性心肌損傷中發揮著重要作用。在脂毒性心肌病細胞模型中CRIF1表達的增加，可能是細胞內的一種代償性自我保護機制。為了進一步闡明CRIF1在其中的作用，我們給予特異性siRNA敲減CRIF1的表達，結果發現， CRIF1下調會進一步增加MCMs凋亡，即CRIF1下調會加重脂毒性心肌損傷。CRIF1可能在脂毒性心肌損傷中發揮重要保護作用，但其通過何種途徑調控細胞凋亡需要進一步研究。

ROS是細胞代謝和穩態維持的重要副產物，線粒體是產生ROS主要場所之一，當細胞中ROS的產生過多，超過抗氧化系統對其清除的能力，可對機體產生有害的氧化應激損傷[15-16]。氧化應激可導致線粒體損傷[17]，而線粒體損傷又進一步增加ROS的生成[18]，兩者形成不斷加劇的惡性循環。大量人體和動物研究均表明，氧化應激參與了脂質超載的反應，氧化應激水平隨著脂質的積累而不斷增加[19]。循環中過高的脂質水平可通過影響心臟線粒體功能導致心肌損傷[8]，線粒體氧化應激在代謝綜合征患者心肌細胞凋亡的發病機制中起主要作用[20]，而心肌細胞凋亡是影響心臟結構和功能的重要因素[21]。這些研究均表明，氧化應激可能介導了脂毒性心肌損傷發生，我們的研究也證明氧化應激可能介導脂毒性心肌損傷，而線粒體CRIF1是否參與其中呢?在骨髓多能間充質細胞中發現，CRIF1可減輕輻射損傷后的氧化應激水平[22]；在內皮細胞中發現，敲減CRIF1的表達可增加ROS生成[23]。這些報道均提示CRIF1可能通過抑制氧化應激發揮細胞保護作用。為了明確CRIF1在脂毒性心肌病中的相關保護機制，我們在敲減CRIF1后檢測了細胞內氧化應激水平，發現MCMs中ROS的水平顯著增加，提示細胞內ROS含量增加可能是CRIF1下調加重MCMs凋亡的內在機制。為了明確這一結論，本研究給予細胞抗氧化劑NAC干預，結果發現，NAC可降低細胞ROS水平，減少CRIF1下調誘導的細胞凋亡,進一步證實了上述結論：CRIF1對MCMs的保護作用可能是通過抑制細胞內的氧化應激實現的。

Figure 3.The effects ofCRIF1knock-down on apoptosis of PA-treated MCMs. A: RT-qPCR; B: Western blot; C: flow cytometry; Mean±SD.n=5.ΦP<0.05vscontrol group;&P<0.05vsvehicle/PA group;$P<0.05vsScra siRNA/PA group.

圖3 敲減CRIF1的表達對棕櫚酸誘導MCMs凋亡的影響

Figure 4.The effects ofCRIF1knock-down on ROS level in PA-treated MCMs. A: DHE staining (×200); B: ELISA. Mean±SD.n=4.ΦP<0.05vscontrol group;&P<0.05vsvehicle/PA group;$P<0.05vsScra siRNA/PA group.

圖4 敲減CRIF1的表達對棕櫚酸誘導MCMs生成ROS的影響

Figure 5.NAC attenuated the PA-treated MCM damage enhanced byCRIF1knock-down. A: ROS level detected by ELISA; B: apoptosis detected by flow cytometry. Mean±SD.n=5.#P<0.05vsDMSO group.

圖5 NAC減輕敲減CRIF1表達加重棕櫚酸誘導所致MCMs損傷的作用

本實驗檢測了脂毒性心肌病狀態下細胞內總CRIF1的變化情況，但其在不同細胞器中表達的有無變化尚不清楚，其抑制ROS產生具體機制仍需進一步探索，后續實驗中我們將采用腺病毒過表達技術進一步探索CRIF1與氧化應激之間的關系。綜上所述，在脂毒性心肌病中，CRIF1可能通過抑制氧化應激反應來發揮心肌保護作用。這為CRIF1在脂毒性心肌病中的作用提供了理論基礎，有利于開發新的防治靶點。