獨活寄生湯對膠原誘導性關節(jié)炎大鼠免疫功能的影響

李浩 袁玉影 賈園園

[摘要]目的 探討獨活寄生湯對膠原誘導性關節(jié)炎（CIA）大鼠免疫功能的影響。方法 50只清潔級雄性Wistar大鼠，適應性飼養(yǎng)7 d后，隨機取6只作為正常組，其余大鼠均左足跖部皮內注射膠原乳劑200 μl/只，制作CIA大鼠模型，以關節(jié)炎指數(shù)（AI）≥4為造模成功。將模型大鼠隨機分為模型組、塞來昔布[0.05 g/（kg·d）]組、獨活寄生湯高濃度[44 g/（kg·d）]組、獨活寄生湯中濃度[22 g/（kg·d）]組和獨活寄生湯低濃度[11 g/（kg·d）]組，對照組和模型組采用等體積蒸餾水處理，1次/d，灌胃30 d。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ABC-ELISA）檢測并比較6組大鼠血清中的T細胞特異性轉錄因子（T-bet）、白細胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）、GATA結合蛋白3（GATA-3）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-13（IL-13）水平。結果 模型組大鼠血清中的T-bet、IL-2和IFN-γ水平高于正常組，GATA-3、IL-6和IL-13水平低于正常組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;塞來昔布組和獨活寄生湯低、中、高濃度組的T-bet水平低于模型組，塞來昔布組和獨活寄生湯中濃度組的IL-2水平低于模型組，塞來昔布組和獨活寄生湯低、中濃度組的IFN-γ水平低于模型組，塞來昔布組和獨活寄生湯低、中、高濃度組的GATA-3、IL-6和IL-13水平高于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論 獨活寄生湯對CIA大鼠可發(fā)揮理想的治療效果，其抗炎機制通過調節(jié)Th1/Th2細胞平衡，使T-bet水平減弱，GATA-3水平增強，抑制免疫炎性因子水平。

[關鍵詞]類風濕性關節(jié)炎;獨活寄生湯;GATA結合蛋白3;T細胞特異性轉錄因子;免疫功能

[中圖分類號] R332? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2020）1（c）-0025-04

[Abstract] Objective To explore the effect of Duhuojisheng Decoction on the immune function of collagen induced arthritis （CIA） rats. Methods A total of 50 clean male Wistar rats were fed adaptively for 7 days， six rats were randomly selected as the normal group， the other rats were injected with 200 μl collagen emulsion into the skin of the left plantar part of their feet to make CIA rat model. Arthritis index （AI）≥4 was used as the model successfully. The model rats were randomly divided into model group， Celecoxib （0.05 g/[kg·d]） group， Duhuojisheng Decoction high concentration （44 g/[kg·d]） group， Duhuojisheng Decoction medium concentration （22 g/[kg·d]） group and Duhuojisheng Decoction low concentration （11 g/[kg·d]） group， The control group and model group were treated with distilled water of equal volume， once a day， and gavage for 30 days. The levels of T cell specific transcription factor （T-bet）， interleukin-2 （IL-2）， interferon-γ （IFN-γ）， GATA binding protein 3 （GATA-3）， interleukin-6 （IL-6） and interleukin-13 （IL-13） in serum of six groups of rats were detected and compared by double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay （ABC-ELISA）. Results The levels of T-bet， IL-2 and IFN-γ in serum of the model group were higher than those of the normal group， and the levels of GATA-3， IL-6 and IL-13 were lower than those of the normal group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The T-bet level of Celecoxib group and Duhuojisheng Decoction low， medium and high concentration group were lower than those of model group， the level of IL-2 in Celecoxib group and Duhuojisheng Decoction medium group were lower than those in model group， the IFN-γ levels of Celecoxib group， Duhuojisheng Decoction low and medium concentration group were lower than those of model group， the levels of GATA-3， IL-6 and IL-13 in Celecoxib group， Duhuojisheng Decoction low， medium and high concentration group were higher than those in model group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion Duhuojisheng Decoction can exert ideal therapeutic effect on CIA rats. Its anti-inflammatory mechanism is to reduce T-bet levels， increase GATA-3 levels， and suppress immune inflammatory factor levels by regulating the Th1 / Th2 cell balance.

[Key words] Rheumatoid arthritis; Duhuojisheng Decoction; GATA binding protein 3; T cell specific transcription factor; Immune function

類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）屬于一類自身系統(tǒng)性慢性疾病，其典型癥狀為對稱性外周小關節(jié)炎，主要病理變化為滑膜炎癥，最終導致軟骨和骨的損傷，病因尚不明確。目前，西醫(yī)治療主要運用非甾體抗炎藥、糖皮質激素及免疫抑制劑等，不良反應較多。中醫(yī)藥治療毒副作用小，同時亦可有效緩解西藥的不良反應，在治療RA中發(fā)揮著重要作用[1]。獨活寄生湯被廣泛應用，現(xiàn)代藥理學顯示，此方劑可發(fā)揮一定功效，包括免疫機能的調控、抗炎、鎮(zhèn)痛等[2-4];其組方可對膠原誘導性關節(jié)炎（collagen induced arthritis，CIA）模型大鼠滑膜組織的病變情況予以有效抑制，相比模型組，病變出現(xiàn)明顯改善[5]。大鼠CIA屬于一類免疫性炎癥，是臨床研究RA疾病普遍應用的一類動物模型。近年研究顯示，中藥治療具有整體調節(jié)、多層次、多靶點的作用[6]，因此，本研究選用獨活寄生湯治療CIA大鼠，以明確相關機制，為本方臨床用于治療RA提供參考。本研究旨在探討獨活寄生湯對CIA大鼠免疫功能的影響，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1實驗動物、試劑和儀器

50只清潔級雄性Wistar大鼠，體重240～260 g，購自長生生物技術有限公司（遼寧），合格證號SCXK（遼）2015-0001。大鼠實驗操作完全符合醫(yī)學院動物倫理委員會要求。獨活寄生湯配方顆粒劑（批號：8050861）、塞來昔布（批號：AN8170，X41713）均購自齊齊哈爾中醫(yī)醫(yī)院;弗氏完全佐劑（FCA）（批號：albr3877v）購自美國Sigma公司;雞Ⅱ型膠原（批號：181105KE16）、GATA結合蛋白3（GATA-3）（批號：181105KE3）、T細胞特異性轉錄因子（T-bet）（批號：181105KE4）ELISA試劑盒與白細胞介素-2（IL-2）（批號：181105KE21）、γ干擾素（IFN-γ）、（批號：181105KE8）、白細胞介素-6（IL-6）（批號：181105KE6）、白細胞介素-13（IL-13）（批號：181105KE13）ELISA試劑盒均購自江蘇晶美生物科技有限公司。MODEL 550型臺式冷凍離心機（德國Eppend-dorf公司），RT-6000 型酶標儀（美國Rayto公司）。水合氯醛（成都德思特生物技術有限公司，批號：DST190826-039）。

1.2造模及分組

1.2.1 CIA大鼠模型的建立? 適應性飼養(yǎng)7 d后，隨機取6只作為正常組，其余大鼠建立模型。稱取0.5 mg Ⅱ型膠原蛋白（CⅡ）放入0.25 ml醋酸（0.1 mol/L）內，于4℃下攪拌至徹底溶解，終濃度為2 g/L，冰箱（4℃）內經(jīng)夜放置;添加等體積的FCA，進行乳化反應，制成CⅡ乳劑，終濃度為1 g/L。初次免疫時，經(jīng)皮內方式將CⅡ由大鼠左足跖部注入，用量為0.2 ml/只，9 d后采取強化免疫處理，注入的CⅡ用量調整為0.1 ml/只，正常組大鼠則將上述試劑調整為等體積生理鹽水，共注射15 d，1次/d[7-8]。

1.2.2模型的篩選? 由初次免疫起，每日對建模動物左后肢腫脹狀況進行觀察（圖1）和評分（0～4級）[9]，關節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）越高，表示其程度越嚴重。于首次免疫完成后第16 d評估AI值，若AI≥4為造模成功，合計30只。20只造模失敗，則棄去[10]。

1.2.3分組及干預? 將模型大鼠隨機分為模型組、塞來昔布[0.05 g/（kg·d）]組、獨活寄生湯高劑量[44 g/（kg·d）]組、獨活寄生湯中劑量[22 g/（kg·d）]組和獨活寄生湯低劑量[11 g/（kg·d）]組，對照組和模型組采用等體積蒸餾水處理，1次/d，灌胃30 d。

1.2.4觀察指標的檢測? 給藥30 d時處死大鼠，水合氯醛10%麻醉，腹主動脈取血2 ml[11]，給予5 min離心處理，轉速為5000 r/min，將上清凍存于液氮內，測定前將標本室溫復融混勻，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ABC-ELISA）檢測大鼠血清中T-bet、IL-2、IFN-γ、GATA-3、IL-6、IL-13水平，按照試劑盒說明書進行操作。

1.3統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計學軟件SPSS 20.0分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，不符合正態(tài)分布的轉化為正態(tài)分布再行統(tǒng)計學分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1大鼠的一般情況

正常組大鼠的精神狀態(tài)良好，飲水量和進食量均無異常，體重無改變，被毛有光澤，行動正常;模型組大鼠精神萎靡、倦怠，進食量減少，體重減輕，毛發(fā)失去光澤，活躍度降低。經(jīng)藥物干預，相比模型組，獨活寄生湯組中劑量組的體重升高明顯，AI值下降，左后肢足墊厚度明顯減小。高劑量組和低劑量組有一定的變化，但變化不明顯。

2.2獨活寄生湯對CIA大鼠血清中T-bet、IL-2、IFN-γ、GATA-3、IL-6、IL-13水平的影響

模型組大鼠血清中的T-bet、IL-2和IFN-γ水平高于正常組，GATA-3、IL-6和IL-13水平低于正常組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;塞來昔布組和獨活寄生湯低、中、高濃度組的T-bet水平低于模型組，塞來昔布組和獨活寄生湯中濃度組的IL-2水平低于模型組，塞來昔布組和獨活寄生湯低、中濃度組的IFN-γ水平低于模型組，塞來昔布組和獨活寄生湯低、中、高濃度組的GATA-3、IL-6和IL-13水平高于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。獨活寄生湯低、高濃度組的IL-2水平與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;獨活寄生湯高濃度組的IFN-γ水平與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（表1）。

3討論

獨活寄生湯來源于《千金方》，包含獨活等15味中藥。該方是治療風寒濕痹日久證的常用名方，具有祛風濕、止痹痛、益肝腎、補氣血等功效，現(xiàn)代醫(yī)學主要用其治療RA等疾病。能抑制白細胞介素的表達而抑制炎癥因子對關節(jié)軟骨的破壞，起到抗炎的作用。RA屬于一類自身免疫性疾病[12]，研究顯示，在正常免疫機能維持方面，Th1/Th2型細胞與此類細胞產(chǎn)生的細胞因子平衡態(tài)發(fā)揮著關鍵作用[13-15]。T-bet為Th1細胞的特異性轉錄因子[16-17]，Th細胞分化為Th1細胞過程中受到T-bet的調控，主要介導免疫功能，生成如IL-2等促炎因子，導致炎癥的發(fā)生[18]。GATA-3在Th2細胞內特異表達，為Th2細胞的特異性轉錄因子[19]，參與每個轉錄活動，Th2細胞主要介導體液免疫，分泌抑炎因子IL-13等，抑制炎癥的發(fā)生。

本研究結果提示在RA中，大鼠T細胞大多分化為Th1，總的趨勢向Th1漂移，破壞Th1/Th2平衡。獨活寄生湯干預后大鼠T細胞向Th2分化，同時抑制Th1細胞分化，Th1/Th2的平衡功能得到恢復，此結論與相關研究結果一致[20]。

綜上所述，獨活寄生湯對CIA大鼠可發(fā)揮理想的治療效果，其抗炎機制通過調節(jié)Th1/Th2細胞平衡，使T-bet水平減弱，GATA-3水平增強，抑制免疫炎性因子水平。

[參考文獻]

[1]李建洪，楊博，狄朋桃，等.中醫(yī)藥治療類風濕性關節(jié)炎研究概況[J].中國民族民間醫(yī)藥，2017，26（13）：41-44.

[2]孟宇航，楊衛(wèi)彬，董寶強.獨活寄生湯加減聯(lián)合針灸治療類風濕性關節(jié)炎的臨床療效分析[J].中醫(yī)藥信息，2018， 35（1）：58-62.

[3]李璘麟，周小莉.獨活寄生湯在風濕病中的臨床應用及研究進展[J].中國中醫(yī)急癥，2019，28（3）：549-552.

[4]張美英，劉佩瑤.獨活寄生湯加減治療風濕性關節(jié)炎的研究概況[J].天津中醫(yī)藥大學學報，2017，36（6）：477-480.

[5]王愛武，劉婭，林曉燕，等.獨活寄生湯及其配方顆粒對膠原誘導型關節(jié)炎大鼠滑膜組織病理學變化的影響[J].中國中醫(yī)藥科技，2010，17（3）：202-203.

[6]楊亞麗，韓璐，喬雪，等.傳統(tǒng)中藥及其活性成分治療類風濕性關節(jié)炎現(xiàn)狀[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2018，14（9）：100-103.

[7]王建，邱彥，李克冉，等.蓍草總倍半萜內酯對類風濕性關節(jié)炎模型大鼠保護作用的實驗研究[J].藥學實踐雜志，2018， 36（6）：529-532.

[8]王燕，陳思思，李澤光.淺談針藥結合治療類風濕性關節(jié)炎的臨床應用及作用機制[J].針灸臨床雜志，2019，35（6）：92-95.

[9]鐵寧，張桂芝.甲氨蝶呤與雷公藤多苷片聯(lián)用對類風濕性關節(jié)炎大鼠的治療作用[J].中國中醫(yī)急癥，2016，25（4）：655-657，674.

[10]張傳英，胡玲，蔡榮林，等.艾灸對類風濕性關節(jié)炎大鼠踝關節(jié)滑膜組織Toll樣受體4/核因子-κB信號通路的影響[J].針刺研究，2018，43（11）：687-691.

[11]田蜜，蔣雪云，曹麗歌，等.不同取血方式及性別對成年Wistar大鼠11種血液生物化學指標的影響[J].首都醫(yī)科大學學報，2017，38（4）：572-575.

[12]杜娟，姚新生，于紅松.HLA基因與常見自身免疫病相關性研究進展[J].中國免疫學雜志，2019，35（1）：118-122， 128.

[13]任舒婷，李玉生.Th1/Th2失衡對于類風濕性關節(jié)炎炎癥損傷的臨床意義[J].標記免疫分析與臨床，2015，22（9）：864-866.

[14]Hye WK，Hyo JP，Hae LK，et al.Cricket paralysis virus internal ribosome entry site-derived RNA promotes conventional vaccine efficacy by enhancing a balanced Th1/Th2 response[J].Vaccine，2019，37（36）：5191-5202.

[15]金學軍.阿奇霉素治療小兒肺炎支原體肺炎臨床療效及對Th1/Th2細胞和炎性因子的影響[J].臨床合理用藥雜志，2019，12（22）：87-88.

[16]郭明，安高，封桂英，等.CD4+T細胞亞群在類風濕性關節(jié)炎中的研究進展[J].細胞與分子免疫學雜志，2014，30（9）：1004-1007.

[17]周志剛，陳麗旦，鄒樹仁，等.左歸丸對陰虛陽亢大鼠Th1/Th2細胞漂移特異性轉錄因子T-bet及GATA-3mRNA的干預作用[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報，2010，12（4）：52-54.

[18]楊林，呂丹，沈小芳，等.細胞因子對類風濕性關節(jié)炎骨平衡的調節(jié)作用[J].生命科學，2019，31（1）：35-43.

[19]楊凡，賈永強，管連城，等.虎耳消銀湯對血熱型銀屑病患者外周血Th細胞相關因子的影響[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2018，14（12）：185-187.

[20]周志剛，顏春明，張學強，等.艾灸對類風濕性關節(jié)炎大鼠Th1/Th2漂移特異性轉錄因子T-bet和GATA-3的干預作用[J].江西中醫(yī)藥，2015，46（5）：28-30.

（收稿日期：2019-08-21? 本文編輯：劉克明）