G蛋白偶聯受體35在胃癌中的表達及其與預后的相關性

徐婷娟，沈國棟，程民，吳新春，胡世蓮

[中國科學技術大學附屬第一醫院(安徽省立醫院)老年醫學研究所，腫瘤免疫與營養治療安徽省重點實驗室，合肥 230001]

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，具有較高的發病率及死亡率[1]。全球癌癥狀況最新數據顯示2012年新增胃癌患者951 600例，因胃癌及其相關原因導致的死亡高達723 100人次[2-3]。近年來雖然內鏡及治療策略如手術切除和化療取得了改進，然而胃癌在全球的平均五年生存期仍僅維持在40%[4]。因此，探尋胃癌新的分子標志物對于提高胃癌診斷的準確性、提供胃癌治療的新靶點以及判斷患者預后有著重要意義[5]。

G蛋白偶聯受體(GPCR)是一個超級膜蛋白受體家族，目前有30%～40%的藥物是將GPCR作為靶標[6]。1998年，G蛋白偶聯受體35(GPR35)首次被發現在大鼠小腸中表達[7]，隨后的研究顯示GPR35在胃腸道、中樞神經系統、心血管系統、肺臟、肝臟、脾臟等多種組織中均有表達[8-10]。由于在相當長時間里沒有發現其內源性配體，GPR35一直被認為是孤兒受體。近年來隨著內源性和合成配體的發現，GPR35在多種疾病中的潛在作用愈發顯現[11-15]。有研究[16]報道，GPR35參與了小鼠胚胎成纖維細胞的轉化，并且在胃癌組織中的表達上調，顯著高于癌旁組織。GPR35及其配體趨化因子17相互作用后能促進乳腺癌細胞的增殖和遷移[17]。

鑒于GPR35在腫瘤進展中的作用，本文基于TCGA數據庫、Oncomine數據庫以及Kaplan-Meier Plotter數據庫，挖掘分析GPR35在胃癌中的表達情況及其與患者預后的相關性，為深入研究GPR35在胃癌發生發展中的作用奠定基礎，以期為胃癌提供新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 TCGA數據庫分析GPR35在胃癌組織中基因組水平的改變 采用cBioportal分析工具(http://www.cbioportal.org/)對腫瘤基因圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA,http://cancergenome.nih.gov/)數據庫中GPR35基因改變頻率進行分析。篩選條件如下：(1)在Select Studies中選擇Stomach Adenocarcinoma；(2)在Select Genomic Profiles中選擇Mutations和Copy number alteration;(3)輸入目的基因GPR35;(4)Submit Query。

1.2 Oncomine數據庫分析GPR35在胃癌組織中mRNA水平的改變 運用Oncomine數據庫(http://www.oncomine.org/)分析GPR35 mRNA水平在不同病理類型的胃癌與正常胃黏膜表達的差異性。篩選條件如下：(1)輸入目的基因GPR35；(2)在Primary Filters，Analysis Type中選擇Cancer vs.Normal Analysis，在Cancer Type中選擇Gastric Cancer；(3)在Dataset Filters，Data Type中選擇mRNA；(4)在datasets選擇Over-expression：Fold Change；(5)選擇展示圖形為箱式圖。

1.3 Kaplan-Meier Plotter數據庫分析 GPR35 mRNA表達水平與胃癌患者生存期的關系 利用Kaplan-Meier Plotter數據庫(http://kmplot.com/analysis/)的胃癌數據集進行在線生存分析。篩選條件如下：(1)選擇gastric cancer數據庫；(2)輸入目的基因GPR35；(3)Survival選擇OS；(4)Draw Kaplan-Meier plot。

1.4 統計學處理 應用SPSS 20.0軟件包對胃癌組織中GPR35表達與臨床病理特征的關系進行統計分析。觀測數據中的計數資料，采用χ2檢驗。計量資料中，正態資料行t檢驗，偏態資料行秩檢驗。生存分析方法為Kaplan-Meier乘積限法，組間比較為Log-Rank檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GPR35在胃癌中表達水平改變的分析

2.1.1 GPR35在胃癌組織中基因組水平改變的分析 采用cBioportal分析工具對TCGA數據庫中GPR35的基因改變頻率進行分析。結果發現：在胃癌中，GPR35的改變形式主要表現為缺失。在TCGA，Provisional數據集中(共393例胃癌患者)，GPR35有3.30%的改變，其中有1.27%的突變(5/393)及2.03%的缺失(8/393)；在TCGA，PanCancer Atlas數據集中(共434例胃癌患者)，GPR35有2.99%的改變，其中有1.15%的突變(5/434)及1.84%(8/434)的缺失。

2.1.2 GPR35在胃癌組織中mRNA水平改變的分析 根據胃癌的發病機制和組織結構的不同，Lauren分型將胃癌分為腸型和彌漫型。本研究分析了Oncomine數據庫中GPR35 mRNA水平在不同病理類型的胃癌與正常胃黏膜表達的差異性。結果發現(見圖1)，在DErrico數據集中，GPR35在腸型胃癌(26例)中的表達較正常胃黏膜(31例)升高1.446倍(P=0.003)，在彌漫型胃癌(6例)的較正常胃黏膜(31例)升高1.468倍(P=0.028)，在混合型胃癌(4例)較正常胃黏膜(31例)降低1.001倍(P=0.501)；在Cho數據集中，GPR35在腸型胃癌(20例)中的表達較正常胃黏膜(19例)升高2.477倍(P=2.67×10-4)，在彌漫型胃癌(6例)較正常胃黏膜(19例)升高2.015倍(P=8.91×10-4)，在混合型胃癌(10例)較正常胃黏膜(19例)升高2.324倍(P=6.70×10-4)。

圖1 應用Oncomine數據庫分析GPR35在胃癌組織中mRNA水平的改變：A為DErrico胃癌數據集，B為Cho胃癌數據集

圖2 Kaplan-Meier Plotter數據庫分析不同時期GPR35與胃癌患者預后的相關性

表1 胃癌組織中GPR35的表達與患者臨床病理特征的關系

2.2 胃癌組織中GPR35的表達水平與患者臨床病理參數之間的關系 分析GPR35在胃癌組織中的表達水平與患者臨床病理參數之間的關系(表1)，結果顯示，GPR35的表達與腫瘤的分化程度(χ2=25.060，P<0.001)、分期(χ2=7.039，P=0.008)、淋巴結轉移(χ2=14.927，P<0.001)和遠處轉移(χ2=28.615，P<0.001)以及HER2表達與否(χ2=153.840，P<0.001)顯著相關，而與患者性別、腫瘤浸潤深度、lauren分型和治療策略均無顯著相關性(P>0.05)。

2.3 GPR35 mRNA表達水平與胃癌患者預后的關系 為了進一步明確GPR35 mRNA表達水平與胃癌患者預后之間的關系，通過Kaplan-Meier Plotter數據庫分析發現：與GPR35低表達的胃癌患者相比，GPR35高表達的胃癌患者總生存期[HR=1.62 (1.36～1.93)，P=3.6×10-8]，首次進展[HR=1.52 (1.24～1.86)，P=4.2×10-5]及進展后生存期[HR=2.53(2.02～3.16)，P<1×10-16]均縮短，患者預后差(圖2)。

3 討論

眾所周知，惡性腫瘤的遠處轉移是占腫瘤相關死亡90%以上的最致命的特點。同樣，侵襲轉移是胃癌最重要的特征[18]。胃癌的高復發率和高轉移率所導致的遠處器官或組織轉移，患者往往預后不良，生存率低。胃癌常見的轉移途徑分為四大類：淋巴結轉移、腹膜轉移、血道轉移和種植轉移。其中淋巴結轉移、腹膜轉移是胃癌轉移最常見形式。接近50%的胃癌轉移是腹膜轉移，胃癌腹膜轉移患者生活質量較差且生存期短，通常中位生存期僅為3～4個月，即使切除原發腫瘤也僅能將中位生存期提高到9～10個月。盡管越來越多的證據顯示化療可提高轉移性胃癌患者的生存期，但其預后仍然很差，中位總生存期約1年[19]。臨床工作中對胃癌術前術后轉移傾向的判斷仍然存在很大的困難，因此，深入研究胃癌轉移途徑的關鍵分子尤為重要，對提高患者術后生存質量和生存率具有重要意義。

本研究發現Oncomine數據庫中GPR35 mRNA在不同分型(腸型、彌漫型和混合型)胃癌中的表達顯著高于正常胃黏膜，這與Okumura等[16]發現GPR35在胃癌組織中的表達顯著高于癌旁組織的結果是一致的。但是在DErrico數據集中混合型胃癌組織的GPR35 mRNA表達較正常胃黏膜降低，差異無統計學意義(P=0.501)，這可能與其臨床樣本量較小有關。本組進一步分析了GPR35在胃癌組織中的表達水平與患者臨床病理之間的關系，發現GPR35的表達與腫瘤的分化程度、分期、淋巴結轉移和遠處轉移顯著相關，即惡性程度越高的患者GPR35的表達越高。尤為重要的是，本研究顯示GPR35的表達與預后生存期之間具有顯著的相關性，高表達GPR35的患者預后較差，提示，GPR35在胃癌中有可能作為臨床預后判定指標。

本研究存在一定的不足之處。TCGA、Oncomine和Kaplan-Meier Plotter數據庫提供的均為mRNA水平的數據，不能完全真實地代表GPR35在蛋白水平表達的實際情況，故在后續的研究中應結合免疫組織化學和Western blot技術在蛋白表達水平上分析驗證GPR35在胃癌侵襲轉移中的作用及相關機制，以期為胃癌治療提供新的靶標。