UPLC-MS/MS法測定蔬菜中多菌靈含量的不確定度評估

石驍昵　李婷　馬宇熙

摘要：目的? 研究超高效液相色譜-質譜聯用（UPLC-MS/MS）法測定蔬菜中多菌靈含量的不確定度。方法? 色譜柱為Waters ACQUITY BEH C18，1.7μm，柱溫：35℃;進樣量5 μl;流動相：A為乙腈，B為0.05%甲酸水;流速：0.3 ml。梯度洗脫條件：0～5 min 30% A，70% B;5～6 min 95% A，5% B;6～7 min 30% A，70% B，采用多反應監測模式進行檢測，對不確定來源進行分析，建立標準曲線模型，計算各變量的不確定度、合成不確定度、擴展不確定度。結果? 超高效液相色譜-質譜聯用法測定蔬菜中多菌靈含量的不確定度，影響最大的是標準溶液配制稀釋過程中產生的不確定度。相對不確定度為0.233，在置信度為95%時，覆蓋因子k=2，擴展不確定度為4.66%。結論? UPLC-MS/MS法測定多菌靈含量對測量不確定貢獻最大的是標準溶液的配制和稀釋過程中產生的不確定度，其次是標準曲線擬合時產生的不確定度。因此在實驗過程中要嚴格操作規程，減少人為誤差。

關鍵詞：多菌靈;蔬菜;超高效液相色譜-質譜聯用;不確定度

中圖分類號：TQ450.7? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.03.054

文章編號：1006-1959（2020）03-0162-03

Evaluation of Uncertainty in Determination of Carbendazim in Vegetables by UPLC-MS/MS

SHI Xiao-ni，LI Ting，MA Yu-xi

（Urumqi Center for Disease Control and Prevention，Urumqi 830026，Xinjiang，China）

Abstract：Objective? To study the uncertainty of determination of carbendazim in vegetables by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry （UPLC-MS/MS）. Methods? The chromatographic column was Waters ACQUITY BEH C18， 1.7 μm， column temperature： 35 °C; injection volume was 5 μl; mobile phase： A was acetonitrile， B was 0.05% formic acid water; flow rate： 0.3 ml.Gradient elution conditions： 0～5 min 30% A， 70% B; 5～6 min 95% A， 5% B; 6～7 min 30% A， 70% B. Multi-reaction monitoring mode was used for detection. Analyze the sources of uncertainty， establish a standard curve model， and calculate the uncertainty， synthetic uncertainty， and expanded uncertainty of each variable.Results? The uncertainty of the determination of carbendazim in vegetables by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry combined with the most significant factor was the uncertainty generated during the preparation and dilution of standard solutions. The relative uncertainty is 0.233.When the confidence is 95%， the coverage factor k=2 and the expanded uncertainty is 4.66%.Conclusion? The most significant contribution to the measurement uncertainty of the determination of carbendazim by the UPLC-MS/MS method is the uncertainty generated during the preparation and dilution of the standard solution， followed by the uncertainty generated during the fitting of the standard curve. Therefore， it is necessary to strictly operate procedures during the experiment to reduce human error.

Key words：Carbendazim;Vegetables;Ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry; Uncertainty

在我國植物殺菌劑已廣泛使用于水果蔬菜種植，其中多菌靈是一種廣譜性殺菌劑，屬于內吸性殺菌劑，通過吸收蔬菜體內產生代謝產物，從而起到殺菌作用。但多菌靈在人體內蓄積，可能引起嘔吐等癥狀，且對生殖系統有很大影響[1]。多菌靈產生的積累性及生物毒性已經引起國家的重視，為了保證蔬菜質量安全，我國對農藥殘留實施了嚴格的檢測，并對不同農作物有一定的限值要求[2，3]，這就對多菌靈檢測結果的可信度和準確度提出了很高的要求。多菌靈的檢測方法有高效液相色譜法、氣相色譜法、氣質聯用法、高效液相色譜-串聯質譜法[4-6]，但以上方法的適用范圍較小，對于復雜基質的農藥殘留測定干擾較大。近年來隨著檢測技術的日益更新，超高效液相色譜-質譜聯用（UPLC-MS/MS）法在測定農藥方面得到廣泛應用[7-9]，UPLC-MS與MS聯用，可以充分發揮兩者的優勢，與傳統的高效液相色譜和質譜聯用（HPLC-MS）相比，顯著提高了定量分析的重復性和可靠性以及定性分析的準確性，較好地適應了現代藥物研究對自動化、高通量分析的需求，已成為藥物分析的重要方法之一[10]。本研究主要探討超高效液相色譜-質譜聯用（UPLC-MS/MS）法測定蔬菜中多菌靈含量的不確定度，現報道如下。

1儀器與試劑

1.1儀器? Xevo-TQ-S Micro超高效液相色譜-質譜聯用儀（美國Waters公司），AE240天平（瑞士Mettler），KQ-500E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），3-30KS冷凍離心機（德國Sigma公司），AH-20全自動均質器（睿科儀器有限公司），Milli-Q Integral 10超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2實驗試劑? 乙腈：色譜純，德國Sigma公司;無水甲酸：色譜純，天津光復精細化工研究所;無水硫酸鎂、氯化鈉：優級純，天津市光復科技發展有限公司;PSA CNW;GCB，Agela Technoiogies;0.22 μm微孔過濾膜，安譜。多菌靈：Dr.Ehrenstorfer GmbH，純度99.6%。

2方法

2.1樣品前處理

2.1.1樣品來源? 市售綠葉蔬菜韭菜、茼蒿、葉用萵苣、油麥菜、小白菜共35份。

2.1.2樣品前處理? 稱取5 g小白菜樣品加入10 ml乙腈，充分震蕩后超聲10 min;加入1 g NaCl，再次充分震蕩1 min，再加入4 g無水MgSO4迅速渦旋1 min。以10000 r/min冷凍離心10 min，取上清液1.0 ml，加入400 mg PSA，10 mg GCB，渦旋1 min，10000 r/min離心5 min，取上清液，過膜，上機測定。

2.2儀器條件

2.2.1質譜條件? 離子源：ESI正離子模式;離子源溫度：150℃;去溶劑氣流量：1000 L/h;去溶劑氣溫度：450℃;錐孔氣流量：50 L/h;監測方式：MRM模式，掃描采集參數：母離子：192.1 m/z;定量離子/碰撞能量：132.1/28 V;定性離子/碰撞能量：160/18 V;錐孔電壓：33 V;保留時間：0.46 min。

2.2.2色譜條件? 色譜柱為Waters ACQUITY BEH C18，1.7 μm，柱溫：35℃;進樣量5 μl;流動相：A為乙腈，B為0.05%甲酸水;流速：0.3 ml。梯度洗脫條件：0～5 min 30% A，70% B;5～6 min 95% A，5% B;6～7 min 30% A，70% B。

2.3標準溶液配制? 稱取10.04 mg Dr.Ehrenstorfer GmbH標準品，置于10.00 ml容量瓶，使用乙腈定容，配制成1 mg/ml多菌靈儲備液。取1.00 ml儲備液于100 ml容量瓶，用乙腈稀釋配制為濃度為10 μg/ml的中間液。取中間液適量，用空白基質配制成測定濃度為0.5、1.0、5.0、10、20、40、80、100 μg/L的基質系列標準工作液。

3結果

3.1測定結果計算? 本文中測定物質為多菌靈，其含量按以下公式計算：Xmg/kg=

注：X：待測物濃度（mg/kg）;C：樣品中待測物濃度（μg/l）（儀器直讀）;V：樣品提取液體積10.00（ml）;M：樣品質量5.00（g）。

3.2不確定度來源分析? 影響不確定的因素有以下3個方面：①多菌靈標準品引入的不確定度，其中包括多菌靈標準品稱量、稀釋、定容引入的不確定度;②標準曲線的擬合引入的不確定度;③樣品制備和測定以及回收率引入的不確定度[11，12]。

3.2.1多菌靈標準品稱量引入的不確定度[ur （m ）]? 根據本實驗所用天平的檢定證書，檢定分度值e=0.1 mg，最大允許誤差為0.5e，即為0.05 mg。按均勻分布，包含因子k=，標準品稱量引起的不確定度為ur=，式中M為標準品稱取量（mg），因此標準品稱量引入的不確定度為ur （m ）=0.00287。

3.2.2標準溶液配制引入的不確定度[ur （C ）]? ①容量瓶引起的不確定度：配制標準溶液所需的容量瓶為10 ml和100 ml。根據本實驗所用玻璃器皿的檢定證書，其中10 ml（V1）A級容量瓶和100 ml（V2）A級容量瓶最大允許誤差α均為±0.02ml，因質譜實驗室溫度控制恒定，故試劑及標準都在相同的環境條件下，可以忽略由溫度引入的不確定度。按均勻分布，包含因子k時容量瓶引入的不確定度為ur （V ）=，x為容量瓶體積（ml），即10 ml容量瓶ur （V1 ）=0.001154，100 ml容量瓶引起的不確定度ur （V2 ）==0.000116。②移液器引起的不確定度：配制標準溶液所需的移液器量2～10 μl（p1），50～200 μl（p2），200～1000 μl（p3），根據檢定證書移液器的允許誤差α分別為±0.10 μl，±1.6μl，±8μl，按照均勻分布，k=，不確定度為分別為ur （p ）=，x為移液器最大量程（μl）。即3種移液器引入的不確定度分別為ur （p1 ）==0.005773，ur（p2 ）==0.004618，ur（p3 ）==0.004618。

由①②可得：在配制標準溶液時，使用1次10 ml容量瓶，2次100 ml容量瓶，2～10 μl移液器使用2次（1次5 μl，1次10 μl），50～200 μl移液器使用3次（1次50 μl，1次100 μl，1次200 μl），200～1000 μl移液器使用4次（1次400 μl，1次800 μl，2次1000 μl），其相對不確定度是：

3.2.3標準曲線擬合引入的不確定度[ur （b ）]? 基質標準曲線共8個點（m=8），每個點測定3次，共測定24次，結果見表1。

共擬合3條標準曲線方程：a為標準曲線的斜率，b為標準曲線的截距平均值。三條曲線分別為y1=7282.72x+76548;y2=7466.96x+68572;y3=7346.91x+80467。b=75196， a=7358.86。

x為基質標準的理論平均值， x=32.0625，j為每組基質曲線的序號（j=1、2、3），i為測定基質標準溶液的序數（i=1，2，3……N）：自相關的方差為SXX=

3.3樣品測量重復性和回收率引入的不確定度做一份空白樣品的加標實驗，加標量為0.10 mg/kg，每份樣品測定6次，計算出多菌靈含量（mg/kg）及回收率（%）、相對標準偏差（%），結果見表2。

3.3.1回收率引入的不確定度[ur （R ）]u （R ）==0.390856，其中S（R）為回收率的標準偏差，回收率相對不確定度ur （R ）==0.004367，其中 R為回收率的平均值。

3.3.2樣品重復性引入的不確定度[ur （y ）]ur （y ）==0.004789，其中S（X）為樣品測定的標準偏差， X為樣品測定平均值。

3.4合成不確定度? 多菌靈測定的相對不確定度為：u=0.233095。

3.5相對擴展不確定度? 置信區間95%，對于本實驗包含因子選擇k=2，則擴展不確定度U= ur（X）×k =0.46619。

4總結

使用UPLC-MS/MS測定蔬菜中的多菌靈含量，結果發現相對不確定度為0.233，在置信度為95%時，覆蓋因子k=2，擴展不確定度為4.66%，小于16.8%的要求值。通過對以上各分量不確定度的研究，發現本實驗中對測量不確定影響的最大分量是標準溶液的配制和稀釋過程中產生的不確定度，其次是標準曲線擬合時產生的不確定度。因此在實驗過程中，應加強對實驗所用量器的檢定，嚴格操作規程，減少人為誤差，從而達到減小測定結果的不確定度，保證實驗數據準確。

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收稿日期：2019-10-29;修回日期：2019-11-12

編輯/杜帆