芹菜素影響非小細胞肺癌A549細胞順鉑敏感性的RAD51基因調控機制研究

莫琳 劉馨 楊慧敏 何欣蓉 王小林 唐春紅

摘 要 目的：從RAD51基因途徑研究芹菜素對非小細胞肺癌（NSCLC）A549細胞順鉑敏感性的影響及其機制。方法：取人肺癌順鉑耐藥細胞A549/DDP，分為對照組（空白培養基）、順鉑組（5 g/L）和芹菜素低、高劑量組（10、20 μmol/L），采用MTT法檢測A549/DDP細胞生長，采用Annexin Ⅴ/PI雙染色法結合流式細胞術檢測其凋亡情況。取A549/DDP細胞，分為順鉑單用組（1、2、4、8、16 μg/mL）和芹菜素聯用組（10 μmol/L，在順鉑基礎上加用），采用MTT法測定并計算細胞增殖抑制率;采用回歸分析模型計算藥物的半數抑制濃度（IC50），并以此計算芹菜素的逆轉指數。將18只裸鼠隨機分為對照組、順鉑單用組和芹菜素聯用組，每組6只，接種A549/DDP細胞使形成移植瘤后，分別腹腔注射生理鹽水、順鉑（2 mg/kg，隔天給藥1次）、順鉑（劑量、用法同前）+芹菜素藥液（30 mg/kg，每天給藥1次），連續給藥18 d，測量小鼠的體質量和移植瘤質量并計算抑瘤率。取人肺癌細胞A549和A549/DDP，分為正常組（A549細胞）、對照組（A549/DDP細胞）、順鉑組（5 g/L，A549/DDP細胞）和芹菜素低、高劑量組（10、20 μmol/L，A549/DDP細胞），分別采用實時熒光定量聚合酶鏈反應和Western blotting法檢測細胞中RAD51的mRNA及其蛋白表達情況。結果：與對照組比較，芹菜素低、高劑量組細胞增長數均顯著降低，凋亡率均顯著升高且顯著高于順鉑組（P<0.05或P<0.01）。聯用芹菜素后，A549/DDP細胞的增殖抑制率均較相應質量濃度的順鉑單用組顯著升高（P<0.05）;芹菜素聯用組的 IC50為（5.81±0.47）μg/mL，顯著低于順鉑單用組的IC50（14.44±0.52）μg/mL（P<0.05）;逆轉指數為2.49。裸鼠抑瘤實驗結果顯示，聯用芹菜素后，A549/DDP荷瘤裸鼠抑瘤率為68.72%，顯著低于順鉑單用組的33.82%（P<0.05）。與正常組A549細胞比較，對照組A549/DDP 細胞中RAD51 mRNA及其蛋白的相對表達量均顯著升高（P<0.05）;與對照組A549/DDP 細胞比較，芹菜素低、高劑量組A549/DDP 細胞中RAD51 mRNA及其蛋白的相對表達量均顯著降低（P<0.05）;與順鉑組A549/DDP 細胞比較，芹菜素低、高劑量組A549/DDP 細胞中RAD51 mRNA及其蛋白的相對表達量均顯著降低（P<0.05）。結論：芹菜素能夠有效逆轉人肺癌順鉑耐藥細胞A549/DDP的耐藥性，其機制可能與下調RAD51基因轉錄及其蛋白表達有關。

關鍵詞 芹菜素;RAD51;非小細胞肺癌;順鉑;耐藥;敏感性

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the effects and mechanism of apigenin on cisplatin sensitivity of NSCLC A549 cells by regulating RAD51 gene. METHODS： Human lung cancer cisplatin-resistant cells A549/DDP were selected and divided into control group （blank culture medium）， cisplatin group （5 g/L）， apigenin low-dose and high-dose groups （10， 20 μmol/L）. MTT assay was used to detect the growth of A549/DDP cells， while the Annexin Ⅴ/PI double staining combined with flow cytometry were used to detect the apoptosis. A549/DDP cells were collected and divided into cisplatin alone group （1， 2， 4， 8， 16 μg/mL）， apigenin combination group （10 μmol/L， based on cisplatin）. MTT method was used to determine and calculate inhibitory rate of cell proliferation. IC50 values of drugs were calculated by regression model， and reversion index of apigenin was calculated. 18 nude mice were randomly divided into control group， cisplatin alone group and apigenin combination group， with 6 mice in each group. After A549/DDP cells were inoculated to form the transplanted tumor， normal saline， cisplatin （2 mg/kg， once every other day）， cisplatin （the same dosage and usage）+apigenin solution （30 mg/kg， once a day） were injected intraperitoneally respectively. After 18 days of continuous administration， the body weight of mice and the mass of the transplanted tumor were detected and the tumor inhibition rate was calculated. Human lung cancer cells A549 and A549/DDP were collected and divided into normal group （A549 cells）， control group （A549/DDP cells）， cisplatin group （5 g/L， A549/DDP cells） and apigenin low-dose and high-dose groups （10， 20 μmol/L， A549/DDP cells）， respectively. mRNA and protein expression of RAD51 were detected by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting assay. RESULTS： Compared with control group， the cell growth of apigenin low-dose and high-dose groups were decreased significantly， apoptosis rates of them were increased significantly and higher than those of cisplatin group （P<0.05 or P<0.01）. After combined with apigenin， proliferation inhibition rate of A549/DDP cells was increased significantly， compared with cisplatin alone group with the same concentration （P<0.05）. The IC50 in the apigenin combination group was（5.81±0.47）μg/mL， significantly lower than （14.44±0.52）μg/mL in cisplatin alone group （P<0.05）， and reversal index of apigenin was 2.49. The results of nude mice tumor inhibition experiment showed that after combined with apigenin， tumor inhibition rate of A549/DDP bearing nude mice was 68.72%， significantly lower than 33.82% in cisplatin alone group. Compared with A549 cells of normal group， relative expression of RAD51 mRNA and protein were increased significantly in A549/DDP cells of control group （P<0.05）. Compared with A549/DDP cells of control group， relative expression of RAD51 mRNA and protein in A549/DDP cells were decreased significantly in apigenin low-dose and high-dose groups （P<0.05）.? Compared with cisplatin group， relative expression of RAD51 mRNA and protein in A549/DDP cells of apigenin low-dose and high-dose group were decreased significantly （P<0.05）. CONCLUSIONS： Apigenin can effectively reverse drug resistance of cisplatin-resistant A549/DDP cells in human lung cancer. The mechanism may be related to the reduction of RAD51 gene transcription and protein expression.

KEYWORDS? ?Apigenin; RAD51; Non-small cell lung cancer; Cisplatin; Drug resistance; Sensitivity

目前，化療是非小細胞肺癌（NSCLC）的主要治療手段之一，其標準化療方案是以鉑類為基礎的聯合化療，但NSCLC患者在治療過程中經常會出現對順鉑耐受的現象，這對化療效果造成了嚴重影響，導致患者生存率低、預后不良[1]。由于NSCLC細胞對順鉑耐藥的機制十分復雜，涉及多個基因和多條通路，因此闡明順鉑耐藥機制及尋找逆轉順鉑耐藥的有效途徑已成為臨床研究關注的重點。隨著分子生物學研究的不斷深入和“精準醫學”概念的提出，越來越多的研究者開始從基因層面去探討疾病的發生進展以及潛在的診療措施[2]。RAD51是一種新發現的蛋白基因，與細胞的生長密切相關，在細胞的增殖、分化、DNA修復和周期轉換中發揮了重要的作用[3]。相關研究報道，在多種腫瘤（如肺癌、食管癌、乳腺癌等）組織中，RAD51蛋白呈異常高表達，提示其異常表達與腫瘤的分化、侵襲和轉移密切相關[4]。芹菜素（Apigenin）是一種生物類黃酮化合物，廣泛存在于自然界的綠色植物中，能夠促進癌細胞凋亡、抑制癌細胞增殖和周期轉換，具有較好的抗腫瘤作用，其在乳腺癌細胞中改善順鉑耐藥的作用也已經得到證實[5]。基于此，本研究針對芹菜素調控RAD51基因表達途徑考察了其對人肺癌A549細胞順鉑敏感性的影響及機制，以期為芹菜素用于NSCLC等癌癥的治療提供實驗基礎。

1 材料

1.1 儀器

JY2000型精密電子天平（上海精密科學儀器有限公司）;680型酶標儀（美國Bio-Rad公司）;HERAcell BB15型CO2細胞培養箱（德國Heraeus公司）;EPS300型電泳儀（上海天能科技有限公司）;UnioⅡ型聚合酶鏈式反應（PCR）儀（德國Biometra公司）;FACSCaliber型流式細胞儀（美國BD公司）;GDS8000型凝膠成像儀（英國UVP公司）;5804R型臺式離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2 藥品與試劑

順鉑原料藥（山東齊魯制藥有限公司，批號：H20183460，純度：99.8%）;芹菜素原料藥（美國Sigma公司，批號：180623，純度：≥98%）;胎牛血清、RPMI 1640培養基（上海明豐生物科技有限公司）;胰蛋白酶消化液、細胞裂解液（美國R&D Systems公司）;RAD51質粒中量抽提試劑盒、RAD51兔單克隆抗體、GAPDH兔單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）;辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG二抗（英國Abcam公司）;青霉素-鏈霉素雙抗、二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）試劑（美國Sigma公司）;Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、RNA提取Trizol試劑盒、TaqMan miRNA 反轉錄試劑盒、SYBR Prellix Ex TaqTM實時PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）;PCR引物（美國Genewiz公司中國總部）;TBST緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）;PVDF膜（美國Bio-Rad公司）;ECL試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、臺盼藍試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）;0.9%氯化鈉注射液（天津百特醫療用品有限公司，作生理鹽水使用）;pH 7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）為本實驗室自制;其余試劑均為分析純或實驗室常用規格;水為超純水。

1.3 細胞

人肺癌細胞A549、順鉑耐藥細胞A549/DDP均購自中國科學院上海細胞庫。

1.4 動物

BALB/c Nude 裸鼠，SPF級，雄性，8～10周齡，體質量20～25 g，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK（滬）2018-0006。裸鼠在SPF級實驗動物中心通風飼養，室內溫度（21±2）℃，相對濕度40%～50%，空氣更換頻率15次/h，12 h光照明暗交替，實驗場所及相關器材均嚴格清洗、消毒。裸鼠均適應飼養1周后進行實驗，期間統一標準喂食、飲水。

2 方法

2.1 細胞培養

將A549細胞和A549/DDP細胞常規培養于含10%胎牛血清的RPM1640培養基中，于37 ℃、5%CO2條件下培養，然后以胰蛋白酶（1 g/L）消化傳代，每3天傳代1次。其中，A549/DDP細胞培養液中添加順鉑（2 μg/mL）以穩定耐藥細胞株的耐藥表型。取對數生長期細胞，以0.1%DMSO的RPMI 1640培養基稀釋（下同），制成相應濃度的單細胞懸液并計數后用于后續試驗。試驗前以臺盼藍染色法測定，細胞存活率均在95%上。

2.2 芹菜素對A549/DDP細胞增殖的影響考察

取“2.1”項下對數生長期A549/DDP細胞，調整細胞濃度為5×104個/mL，按每孔100 μL加至96孔板中，隨機分為對照組、順鉑組和芹菜素低、高劑量組。對照組僅加入A549/DDP細胞;順鉑組加入順鉑（終質量濃度為5 μg/mL，劑量參考臨床用藥量對應的血藥濃度設置）+A549/DDP細胞;芹菜素低、高劑量組同法加入不同劑量芹菜素（終濃度為10、20 μmol/L，劑量參考文獻[6]設置）+A549/DDP細胞。順鉑原料藥以無菌生理鹽水制成10 g/L的母液，芹菜素原料藥以DMSO溶液制成10 mmol/L的母液，試驗時均以RPMI 1640培養基稀釋至相應濃度。

采用MTT法檢測細胞的增殖能力。各組細胞在37 ℃、5%CO2條件下分別培養24、48、72 h后，每孔加入MTT試劑20 μL繼續培養4 h。使用酶標儀在495 nm波長處測定各孔細胞光密度（OD）值，OD值越大則表示細胞增長數越多。試驗均重復3次。

2.3 芹菜素對A549/DDP細胞凋亡的影響考察

采用Annexin Ⅴ/PI雙染色法結合流式細胞術檢測細胞凋亡情況。取對數生長期A549/DDP細胞，按“2.2”項下方法按每孔1×106個加至96孔板中，隨機分為對照組、順鉑組和芹菜素低、高劑量組，并同法給藥。各組細胞在37 ℃、5%CO2條件下培養48 h后，以RPMI 1640培養基制成1×106個/mL的單細胞懸液，以800 r/min離心5 min，PBS洗滌，加入Annexin Ⅴ-FITC試液5 μL、PI試液10 μL混勻后染色30 min。采用流式細胞儀檢測細胞凋亡數并計算凋亡率：細胞凋亡率=凋亡細胞數/（凋亡細胞數+正常細胞數）×100%。試驗均重復3次。

2.4 芹菜素聯用對A549/DDP細胞順鉑敏感性的影響考察

依據“2.2”項下芹菜素對A549/DDP細胞增殖的影響考察結果，采用MTT法考察芹菜素聯用對A549/DDP細胞順鉑敏感性的影響。取對數生長期A549/DDP細胞，按“2.2”項下方法接種至96孔板中，分別加入不同質量濃度的順鉑（1、2、4、8、16 μg/mL，劑量參照文獻[6]設置）作為順鉑單用組;另設芹菜素聯用組，即在加入上述質量濃度順鉑的基礎上同時加入芹菜素（10 μmol/L）。各組細胞在37 ℃、5%CO2條件下培養24 h后，加MTT 試劑20 μL 繼續培養4 h。采用酶標儀在495 nm波長處測定各孔細胞OD值并計算細胞增殖抑制率：增殖抑制率（%）=（1-芹菜素聯用組OD平均值/相應質量濃度順鉑單用組OD平均值）×100%。采用回歸分析模型計算藥物的半數抑制濃度（IC50）。以IC50值計算芹菜素的逆轉指數：逆轉指數=順鉑單用組IC50值/相應質量濃度芹菜素聯用組IC50值。試驗均重復3次。

2.5 芹菜素聯用對順鉑作用后A549/DDP荷瘤裸鼠抑瘤情況的影響考察

將18只裸鼠隨機分為對照組、順鉑單用組和芹菜素聯用組，每組6只。將含有A549/DDP細胞（1×106個）的PBS溶液200 μL皮下注射至裸鼠腋下區域，1～2周后可見腫瘤組織塊生長。每2天用卡尺測量移植瘤長徑（A，mm）和短徑（B，mm），計算移植瘤體積（V，mm3）：V=A×B2×π/6。當移植瘤生長至20～25 mm3時，對照組裸鼠注射等量生理鹽水，順鉑單用組裸鼠腹腔注射順鉑藥液（2 mg/kg，隔天給藥1次，劑量參照文獻[7]設置），芹菜素聯用組裸鼠在順鉑給藥的基礎上腹腔注射芹菜素藥液（30 mg/kg，每天給藥1次，劑量參照前期實驗結果設置），均連續給藥18 d。順鉑、芹菜素藥液均以生理鹽水制成所需濃度，無菌濾器過濾，當天使用。給藥期間每天測量并計算移植瘤體積，記錄裸鼠的體質量變化。給藥結束后，處死裸鼠并剝離移植瘤組織塊，稱定瘤組織質量并計算抑瘤率：抑瘤率=（對照組移植瘤組織質量-給藥組移植瘤組織質量）/對照組移植瘤組織質量×100%。

2.6 不同細胞中RAD51 mRNA表達及芹菜素對其影響考察

取“2.1”項下對數生長期細胞，按“2.2”項下方法以1×106個/孔加入96孔板，隨機分為正常組、對照組、順鉑組和芹菜素低、高劑量組。正常組加入A549細胞（以含0.1%DMSO的RPMI 1640培養基稀釋，下同）;對照組、順鉑組和芹菜素低、高劑量組加入 A549/DDP細胞和相應藥物。各組細胞在37 ℃、5%CO2條件下培養24 h后，采用Trizol試劑盒提取細胞總RNA，再采用逆轉錄試劑盒對其進行逆轉錄獲得cDNA（逆轉錄反應條件：42 ℃，反應30 min;逆轉錄酶失活條件：85 ℃，反應15 s）。按照實時PCR試劑盒說明書要求操作，進行逆轉錄定量PCR檢測（引物序列見表1）。PCR擴增反應條件：95 ℃預變性5 min;95 ℃變性20 s，60 ℃退火30 s，40個循環;75 ℃延伸10 min。取PCR產物5 μL，加載樣緩沖液1 μL，在20 g/L瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙啶染色后，采用凝膠成像儀分析。以GAPDH為內參，采用Image J 1.48軟件分析目標基因的蛋白表達產物的相對灰度值，用來表示其mRNA的相對表達量。試驗均重復3次。

2.7 不同細胞中RAD51蛋白的表達及芹菜素對其影響考察

采用Western blotting法檢測細胞中RAD51蛋白表達水平。按“2.6”項下方法將A549細胞和A549/DDP細胞進行分組、給藥，在37 ℃、5%CO2條件下培養24 h。取細胞進行蛋白裂解，并采用BCA法檢測蛋白質濃度。使用10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，以PVDF膜進行轉膜;室溫下以5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST緩沖液漂洗3次;先后加入RAD51抗體、GAPDH抗體（稀釋度均為1 ∶ 500）于4 ℃孵育12 h，再加入二抗（稀釋度1 ∶ 5 000）于室溫下孵育60 min，然后采用ECL試劑進行化學發光檢測。以 GAPDH 作為內參，采用凝膠成像儀分析，并以Quantity One 4.6.6圖像處理軟件分析目標蛋白條帶的相對灰度值，用來表示其相對表達量。試驗均重復3次。

2.8 統計學方法

使用SPSS 20.0軟件對實驗數據進行統計分析。實驗數據均以x±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，同一指標不同時間點的比較采用重復測量方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 芹菜素對A549/DDP細胞增殖的影響

與對照組比較，在藥物作用48、72 h后，各給藥組細胞增長數均顯著降低（P<0.05），而在作用24 h時各組間細胞增長數差異均無統計學意義（P > 0.05），詳見表2。為排除芹菜素本身可能存在的細胞毒性作用而造成對增敏試驗結果的干擾，故選擇以10 μmol/L芹菜素作用24 h來考察其對A549/DDP細胞順鉑敏感性的影響。

3.2 芹菜素對A549/DDP細胞凋亡的影響

與對照組比較，各給藥組A549/DDP細胞凋亡率均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與順鉑組比較，芹菜素低、高劑量組A549/DDP細胞凋亡率顯著升高（P<0.01）。各組細胞凋亡流式細胞圖見圖1，凋亡率檢測結果見表3。

3.3 芹菜素聯用對A549/DDP細胞順鉑敏感性的影響

隨著順鉑質量濃度增加，順鉑單用組A549/DDP細胞的增殖抑制率逐漸升高;在聯用10 μmol/L芹菜素后，A549/DDP細胞的增殖抑制率（除順鉑質量濃度為1 μg/mL時）較相應質量濃度的順鉑單用組顯著升高（P<0.05），詳見表4。芹菜素聯用組的 IC50為（5.81±0.47）μg/mL，較順鉑單用組的IC50（14.44±0.52）μg/mL顯著降低（P<0.05）;芹菜素的逆轉指數為2.49。

3.4 芹菜素聯用對順鉑作用后A549/DDP荷瘤裸鼠抑瘤情況的影響

建模結束后，與對照組比較，各給藥組裸鼠體質量和移植瘤體積差異均無統計學意義（P>0.05）;給藥結束后，與對照組比較，各給藥組裸鼠體質量、移植瘤體積和瘤組織質量均顯著降低，且芹菜素聯用組顯著低于順鉑單用組（P<0.05）;芹菜素聯用組的抑瘤率為68.72%，顯著高于順鉑單用組的33.82%（P<0.05），詳見表5。

3.5 不同細胞中RAD51 mRNA表達差異及芹菜素對其表達的影響

與正常組A549細胞比較，對照組A549/DDP 細胞中RAD51 mRNA的相對表達量顯著升高（P<0.05）;與對照組A549/DDP 細胞比較，芹菜素低、高劑量組A549/DDP 細胞中RAD51 mRNA的相對表達量均顯著降低（P<0.05）;與順鉑組A549/DDP 細胞比較，芹菜素低、高劑量組A549/DDP 細胞中RAD51 mRNA的相對表達量均顯著降低（P<0.05）。各組細胞中RAD51 mRNA的相對表達量見表6。

3.6 不同細胞中RAD51蛋白表達差異及芹菜素對其表達的影響

與正常組A549細胞比較，對照組A549/DDP細胞中RAD51蛋白的相對表達量均顯著升高（P<0.05）;與對照組A549/DDP 細胞比較，芹菜素低、高劑量組A549/DDP 細胞中RAD51蛋白的相對表達量均顯著降低（P<0.05）;與順鉑組A549/DDP 細胞比較，芹菜素低、高劑量組A549/DDP 細胞中RAD51蛋白的相對表達量均顯著降低（P<0.05）。各組細胞中RAD51蛋白的相對表達量見表6。

4 討論

鉑類藥物迄今為止仍是臨床治療肺癌應用最廣泛的一線化療藥物[1]。但隨著治療時間的推移，鉑類藥物的耐藥問題日益嚴重，造成患者化療失敗、腫瘤復發。因此，如何減少甚至逆轉腫瘤細胞對于鉑類藥物的耐藥性是改善患者預后、提高患者生存率的關鍵。據既往文獻報道，鈣通道拮抗劑等能夠逆轉腫瘤細胞耐藥性，但往往由于中毒劑量與逆轉耐藥性劑量太過接近，限制了其臨床應用[8-9]。

芹菜素是一種生物類黃酮化合物，隨著對芹菜素應用于抗癌領域的研究不斷深入，有學者研究發現，芹菜素對腫瘤細胞具有高度選擇性，能夠高選擇性地誘導腫瘤細胞凋亡，而不損傷正常細胞[5];且芹菜素攝入體內后對多種類型的腫瘤均能產生預防作用[10]。陳況況等[11]指出，芹菜素能促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移，同時能夠干擾腫瘤細胞的多種信號傳導途徑等，對肝癌、肺癌、食管癌、乳腺癌、肺癌、肝癌等多種腫瘤細胞具有一定的抑制作用。趙亞新等[12]通過體外實驗研究證實，芹菜素能夠通過抑制MDR1基因轉錄和P糖蛋白介導的藥物外轉運功能進而逆轉人乳腺癌阿霉素耐藥細胞MCF-7/ADR的多藥耐藥性。但芹菜素在NSCLC治療中能否同樣逆轉腫瘤細胞的耐藥性及其具體機制仍無確切定論。近年來，臨床上已有研究證實了RAD51基因與NSCLC的順鉑耐藥性存在密切關聯[13]。有研究指出，抑制范可尼貧血（FA）通路DNA的交聯損傷修復功能，能夠改善肺癌細胞耐藥、增強順鉑的細胞毒性及其介導的促細胞凋亡作用，而RAD51是FA通路中重要的下游基因，敲除RAD51 C等位基因后可增加人肺癌細胞Calu-1對順鉑的敏感性[14]。因此，本研究基于芹菜素對RAD51基因表達的調控途徑，以人肺癌細胞A549及其順鉑耐藥細胞A549/DDP為對象，通過體內外研究探討芹菜素對NSCLC腫瘤細胞化療藥物敏感性的影響及其機制。

本研究結果顯示，與對照組比較，在藥物作用48、72 h后，順鉑組和芹菜素低、高劑量組A549/DDP細胞增長數均顯著降低，而作用24 h時各組間細胞增長數比較，差異均無統計學意義，這表明芹菜素對A549/DDP細胞增殖有顯著抑制作用，且這一作用有隨芹菜素濃度升高和作用時間延長而增強的趨勢。細胞凋亡試驗結果顯示，與順鉑比較，10、20 μmol/L芹菜素作用后能夠更顯著地促進A549/DDP細胞的凋亡。在此基礎上，為排除芹菜素的細胞毒作用的影響，本研究選用10 μmol/L芹菜素聯合處理24 h，考察A549/DDP細胞對順鉑的敏感性變化，結果芹菜素聯用組的IC50值較相應質量濃度的順鉑單用組顯著降低，表明聯用芹菜素能使A549/DDP細胞對順鉑的敏感性顯著升高;芹菜素具有逆轉腫瘤細胞耐藥的作用，其逆轉指數高達2.49。裸鼠抑瘤實驗結果也顯示，芹菜素聯用組裸鼠的移植瘤組織質量顯著低于順鉑單用組，其抑瘤率達到68.72%，顯著高于順鉑單用組的33.82%，表明芹菜素能提高順鉑對A549/DDP荷瘤裸鼠的抑瘤作用。體內外試驗均提示芹菜素可逆轉A549/DDP 細胞的耐藥性，增加腫瘤細胞/組織對順鉑的敏感性。

腫瘤細胞耐藥涉及多種因素，而鉑類藥物破壞腫瘤細胞DNA雙鏈結構后的DNA結構損傷修復是造成耐藥的重要原因，其中同源重組是DNA雙鏈斷裂修復的重要機制之一[15]。而耐藥相關基因表達和調控的異常以及遺傳機制、表觀遺傳機制調控的異常等與腫瘤化療耐藥密切相關。RAD51基因可以經由同源重組來修復雙鏈斷裂的生物遺傳物質DNA[16]。研究證實，RAD51蛋白是DNA雙鏈同源重組修復通路中的重要蛋白，其在肺癌、宮頸癌、胰腺癌和膀胱癌等多種腫瘤組織中均呈異常高表達，且與這些腫瘤的病理分期、分化程度、轉移及預后密切相關，是造成腫瘤細胞對鉑類藥物化療和放療耐藥的重要因素[17-18]。許多藥物可以通過下調或抑制RAD51的表達達到化療或是放療增敏的作用，例如奧拉帕尼可以通過間接抑制RAD51介導的雙鏈斷裂修復增加對結腸癌細胞的細胞毒性[19]，大黃素能夠通過26S蛋白酶體降解作用促進吉非替尼誘導RAD51蛋白的不穩定性來增加吉非替尼對肺癌細胞的殺傷作用[20]。本研究檢測了A549細胞和A549/DDP細胞中RAD51 mRNA及其蛋白的表達水平以及芹菜素干預的影響，結果顯示，對照組A549/DDP細胞中RAD51 mRNA及其蛋白的表達水平明顯高于正常組A549細胞，提示RAD51與NSCLC的化療藥耐藥存在關聯;而采用芹菜素處理后，A549/DDP細胞中RAD51 mRNA及其蛋白表達水平較順鉑組均顯著降低，表明芹菜素可下調RAD51基因的轉錄和蛋白表達。這提示，芹菜素可能通過下調RAD51 mRNA及其蛋白表達，引起FA通路功能障礙，從而抑制NSCLC腫瘤細胞的DNA修復，逆轉耐藥腫瘤細胞對鉑類藥物的耐藥性，進而誘導腫瘤細胞凋亡并抑制其增殖，有望開發為新型的抗腫瘤藥物和化療增敏劑。

綜上所述，芹菜素能夠有效逆轉人肺癌順鉑耐藥細胞A549/DDP的耐藥性，其機制可能與下調RAD51基因轉錄及其蛋白表達有關。

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（收稿日期：2019-06-30 修回日期：2020-02-13）

（編輯：段思怡）