豬流行性腹瀉病毒FJLY1703 株ORF3 基因遺傳進化及序列分析

董 波，戴愛玲，李曉華，楊小燕

（1. 龍巖學院 生命科學學院，福建 龍巖 364012；2. 龍巖學院 福建省家畜疫病防治與生物技術重點實驗室，福建 龍巖 364012）

豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）以哺育仔豬最為易感，死亡率達到80～100%[1,2]。1984 年PEDV 在我國首次報道，繼而呈現大面積流行趨勢[3]。張志等人對我國29 個省（市）的豬腹瀉性疾病樣品進行檢測分析發現，引起我國豬群腹瀉的主要病原為PEDV[4,5]。因此，及時有效的檢測可以降低PEDV 對養豬業的威脅。

PEDV 由4 個結構蛋白和2 個非結構蛋白構成，排列順序為：5′-ORF(1a/1b)-S-ORF3-E-M-N-3′[6,7]。目前，對非結構蛋白ORF3 基因的功能了解甚少。有學者指出，ORF3 基因包含4 個跨膜區，并能夠形成四聚體結構，具有離子通道活性，從而影響病毒毒力[8]。也有學者認為，ORF3 基因對病毒的適應性和毒力的影響可作為PEDV 強、弱毒株的鑒定依據[9,10]。分子結構特征表明ORF3 基因存在易變異的區域片段，遺傳進化具有不穩定性[11]。因此，ORF3 可作為PEDV 流行病學研究的靶基因。

2010 年末，我國大多數省份暴發PED，疫情蔓延迅速，接種過PEDV 疫苗的豬只同樣發病，給我國養豬業帶來巨大經濟損失[12]。2011 年冬末，廣東、福建等地區持續暴發仔豬腹瀉，而造成PED流行的原因是PEDV 發生突變，即出現PEDV 新型變異株[13]。因此，掌握PEDV 的流行規律和遺傳進化關系是必要的。本研究從閩西地區送檢仔豬組織樣本中分離出PEDV FJLY1703 株，已對該毒株4 個主要結構基因進行了遺傳進化分析，證明為PEDV 新型變異株。然而，考慮到ORF3 基因在病毒研究中的價值，本研究對FJLY1703 株的ORF3 基因進行擴增與測序，并與國內外毒株ORF3 基因序列進行同源性分析、繪制系統發育進化樹、抗原表位預測比較以及重組分析。

1 材料與方法

1.1 病毒與試劑

PEDV FJLY1703 株由福建省家畜疫病防治與生物技術重點實驗室分離并保存。TransZol Up Plus RNA Kit、EasyScript? One-Step RT-PCR SuperMix、EasyScript? Quick Gel Extraction Kit、EasyScript? Plasmid MiniPrep Kit，購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 病毒總RNA 的提取

取腸道樣品約40 mg 放入預冷的研缽內部，研磨至糜爛狀，加入400μL PBS。轉入到1.5μL EP管中，按照操作步驟依次加入1 ml TransZol，200μL氯仿，等體積無水乙醇，500μL 裂解液，500 μL洗滌液。離心洗脫后，-80 ℃保存。

1.3 ORF3 基因的擴增與純化

參考GenBank 已收錄PEDV 毒株的ORF3 序列，使用Premier Premier 5.0 生物軟件設計一對特異性引物PEDV-ORF3-F（AAGGTCTACGTGCAG TGATGT)和PEDV-ORF3-R（TACTAGACCATTAT CATTCACT）。以RNA 為模板，進行一步法RT-PCR擴增。PCR 反應程序為：45 ℃逆轉錄30 min。95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環，72 ℃延伸10 min。使用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，觀察并記錄結果。將陽性樣品按照EasyScript? Quick Gel Extraction Kit 操作說明進行純化。

1.4 同源性及遺傳進化分析

從NCBI 獲取參考毒株的核苷酸序列與氨基酸序列。使用MGEM5.2[14]及DNAMAN 分子生物學軟件，分析FJLY1703 ORF3 基因序列與國內外已發表毒株序列同源性及遺傳進化關系。

1.5 氨基酸序列及潛在抗原表位分析

使用DNAMAN 對FJLY1703 毒株、早期疫苗株CV777 以及其它引用毒株的ORF3 氨基酸易變位點進行分析并記錄結果。使用在線軟件NetMH C 4.0 Serve（https://www.expasy.org/proteomics）對FJLY1703 毒株、早期疫苗株CV777 以及其它引用毒株ORF3 基因潛在抗原表位進行預測分析，并記錄結果。

1.6 ORF3 基因的重組分析

分析 FJLY1703 株與本研究中下載的其它PEDV 病毒株ORF3 基因核苷酸序列的相似性和重組事件。利用遺傳算法重組檢測（GARD）對重組位點進行篩選[15]。使用SimPlot 3.5 對核酸相似性進行掃描分析[16]。

2 結果

2.1 PCR 擴增結果

圖1 ORF3 基因PCR 擴增產物

PCR 結果顯示獲得基因片段大小約為700 bp（見圖1）。PCR 產物測序后經BLAST 比對鑒定為PEDV ORF3 基因。

2.2 同源性及遺傳進化分析

FJLY1703 株ORF3 基因核苷酸序列與21 株引用毒株之間的一致性為95.6%～99.6%，與2010 年后中國變異株的一致性為97.8%～99.6%，與疫苗株CV777 的一致性為95.6%。22 株毒株可分成2 大群，G1 群和G2 群（見圖2）。其中，G2 大群還可細分為G2a 和G2b 兩個亞群，而早期韓國疫苗株virulent DR13、本研究分離株FJLY1703 株以及其它流行變異株同屬G2b 亞群。

圖2 ORF3 遺傳進化分析

2.3 氨基酸序列分析

與早期疫苗株CV777 相比，ORF3 基因推導的氨基酸序列中存在7 處突變，分別為20V-A，53V-I，78V-I，79F-V，91L-F，100A-T，165N-S，181H-Q，這些突變位點與2010 年后中國變異株一致。

2.4 抗原表位預測分析

通過在線軟件NetMHC 4.0 Serve 預測ORF3氨基酸抗原表位區域，結果顯示，CV777 株與FJLY1703 株ORF3 基因中存在3 處不同的抗原表位區域，其余抗原表位區域均相同。而FJLY1703株與國內流行變異株抗原表位位置相同，沒有明顯差異（見表1）。

表 1 FJLY1703 與CV777 ORF3 抗原表位差異位點

2.5 ORF3 基因核酸相似性

GARD 分析顯示 ORF3 核苷酸序列中不存在斷點，沒有發生重組現象。使用Sim-Plot 3.5 對核酸相似性進行掃描顯示，FJLY 1703株ORF3 基因核苷酸算序列與同屬G2a 亞群中其它毒株核酸相似度高，而與G2b 亞群和G1 群毒株相似度低（圖3）。

圖3 FJLY1703 株與其它毒株ORF3 基因核酸相似性

3 討論

同源性及遺傳進化分析表明，FJLY1703 株ORF3 基因與我國其它分離毒株具有很高的同源性，這與之前報道FJLY1703 株N、E、M 和S 基因結果相一致[17]，進一步證實閩西FJLY1703 株屬于2010 年后國內流行變異株。當前，國內已有多個地區開展了PEDV ORF3 基因的遺傳進化分析，學者們普遍認為當前PEDV 國內流行變異株與早期經典疫苗株CV777 遺傳關系較遠。朱前磊[18]等對2015-2017 年河南地區15 株PEDV ORF3 基因遺傳進化分析后表明，河南毒株ORF3 基因與國內流行變異株遺傳關系較近，且與經典疫苗株CV777 遺傳關系較遠。向萌[19]等對四川地區PEDV SCXM 株ORF3 基因同源性分析后顯示，SCXM與經典疫苗株同源性較低，屬于國內PEDV 新型變異株，表明以CV777 株為免疫原制備的疫苗可能對當前豬群保護效果不理想。

序列分析表明，FJLY1703 株與早期疫苗株CV777 相比，ORF3 基因推導的氨基酸序列中存在與流行變異株7 相同突變位點，推測這些突變可能導致PEDV 的毒力差異，從而加劇了2010 年疫情危害。此外，FJLY1703 株并未顯示ORF3 序列缺失，與其它國內流行變異毒株相一致，說明FJLY1703 株為PEDV 野生型毒株。抗原表位預測分析顯示，FJLY1703 株與早期疫苗株CV777 存在3 處不同表位區域，說明FJLY1703 株與早期疫苗株CV777 抗原表位存在不同，這可能是免疫失敗的原因之一。并且，FJLY1703 株與其它國內流行變異株抗原表位預測結果相同，證明國內流行變異株ORF3 基因抗原表位之間具有相對保守的特性，預測的抗原表位可以作為研制PEDV 靶向性疫苗的候選靶點。

此外，本研究顯示早期韓國疫苗株virulent DR13 與國內流行變異株親緣關系較近。有報道推測變異株N 基因可能來源于早期韓國株[17-20]。本研究表明FJLY1703 株等國內流行變異株ORF3 基因與韓國virulent DR13 也具有較高的親緣關系，推測國內流行株ORF3 基因也可能起源于早期韓國株。有報道指出，2010 年后中國PEDV 流行毒株源于早期經典毒株和變異毒株的重組[21]。本研究對FJLY1703 株與其余21 株PEDV 毒株進行了核酸相似性和重組分析，結果顯示FJLY1703 株與遺傳進化關系相近的G2a 亞群毒株具有很高的相似度，而與G1 群的早期毒株相似度低，表明ORF3基因中不存在重組信號。這一結果為PEDV 變異株重組現象主要發生于S 基因提供了進一步的證據[22]。G2a 和G2b 亞群流行毒株ORF3 基因相似度不高，說明ORF3 基因在流行毒株之間易出現變異，提示在PEDV 防控過程中要加以注意。