結(jié)腸癌中SIX2 基因的表達(dá)及預(yù)后的生物信息學(xué)分析

許源民 徐阿曼（通訊作者）

( 安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科 安徽 合肥 230032）

前言

盡管全球醫(yī)學(xué)發(fā)展迅速，癌癥的發(fā)病率和死亡率依然上升很快，其中結(jié)腸癌的發(fā)病和病死率在所有癌癥中排名較高[1]。早期結(jié)腸癌患者可以通過手術(shù)治愈，但晚期結(jié)腸癌患者多伴有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，其5 年生存率低于10%[2-3]。隨著化療和靶向藥物的使用，結(jié)腸癌患者的總生存率顯著高于以前。因此，尋找結(jié)腸癌早期診斷的分子生物學(xué)標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)可能成為進(jìn)一步提高結(jié)腸癌生存率的主要研究方向，盡管癌胚抗原（CEA）在結(jié)腸癌診斷中有著廣泛的應(yīng)用[4-5]。仍然需要尋找更多有效的生物標(biāo)志物。

SIX2 是SIX 家族6 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的成員之一，在多種胚胎組織的發(fā)育過程中起著重要作用[6]。先前的研究[7]表明SIX2 在腎臟形成中具有重要意義。近年來，一些證據(jù)表明SIX2 與不同類型的癌癥相關(guān)[8-10]。Song 等人的研究[8]提示SIX2 可作為腎母細(xì)胞瘤的診斷和預(yù)后標(biāo)志物。Liu 等人的研究[9]表明SIX2 與非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者生存率降低有關(guān)。最近，有文章指出SIX2 與肝細(xì)胞癌預(yù)后不良有關(guān)[10]。然而，SIX2 在結(jié)腸癌中的作用和機(jī)制仍不清楚。

本目的是利用癌癥基因組圖譜（TCGA）中的數(shù)據(jù)評(píng)估SIX2對結(jié)腸癌患者預(yù)后的影響。分析了SIX2 的表達(dá)對結(jié)腸癌患者臨床病理特征和總生存率的影響，得出結(jié)論：SIX2 的表達(dá)增加與結(jié)腸癌患者預(yù)后不良有關(guān)。經(jīng)Logistic 回歸分析，SIX2 表達(dá)與腫瘤分期、浸潤深度（T）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N）（P=0.002）和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M）明顯相關(guān)。Cox 回歸分析顯示SIX2 表達(dá)可能是結(jié)腸癌獨(dú)立的預(yù)后因素,據(jù)此繪制列線圖來預(yù)測結(jié)腸癌患者的1 年、3 年和5 年生存率。

1.材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源和方法

2019 年11 月，從基因組癌圖譜網(wǎng)站檢索結(jié)腸癌患者的RNA測序數(shù)據(jù)（41 個(gè)正常組織和473 個(gè)腫瘤組織）和臨床資料（459例）。使用R 語言（v.3.5.1）和Perl 語言（v.5.30.0.1）從數(shù)據(jù)集中提取相關(guān)信息。通過與正常組織比較，分析SIX2 在腫瘤組織中的表達(dá)。根據(jù)TCGA 標(biāo)本id，將腫瘤組織與正常組織進(jìn)行配對，并比較SIX2 在同一標(biāo)本結(jié)腸和正常組織中的表達(dá)水平。根據(jù)459 例結(jié)腸癌患者的臨床資料與SIX2 基因的表達(dá)量，采用logistic 回歸和多因素Cox 回歸分析。列線圖是腫瘤學(xué)中廣泛使用的一種預(yù)測工具，特別是對癌癥預(yù)后的預(yù)測有重要意義。列線圖用來預(yù)測結(jié)腸癌患者的1 年、3 年和5 年生存率。

1.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有統(tǒng)計(jì)分析均使用R（v.3.5.1）完成。采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)比較正常組織和腫瘤組織中SIX2 表達(dá)的差異。用logistic 回歸和Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)確定SIX2 表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性。應(yīng)用Cox 回歸和Kaplan-Meier 方法分析臨床病理特征與預(yù)后的關(guān)系。

2.結(jié)果

2.1 SIX2 在正常和腫瘤組織中的表達(dá)差異

如圖1（A-B）所示，散點(diǎn)圖顯示正常組織（n=41）和腫瘤組織（n=473）之間SIX2 的差異表達(dá)。值得注意的是，與同一樣本的正常組織相比，SIX2 在腫瘤組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，提示SIX2 的過度表達(dá)可能與結(jié)腸癌的發(fā)生有關(guān)。

2.2 結(jié)腸癌患者的臨床信息

459 例結(jié)腸癌患者診斷時(shí)的中位年齡為68 歲。其中男性243 例，女性216 例。13 例曾接受放射治療，163 例接受藥物治療。此外，68 例患者AJCC 分期為Ⅰ期，166 例為Ⅱ期，146 例為Ⅲ期，65 例為Ⅳ期，其中T1 期腫瘤11 例，T2 期腫瘤78 例，T3 期腫瘤313 例，T4 期腫瘤56 例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為41.2%（n=189），遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率為16.4%（n=67）。其中357 例仍然存活。

2.3 SIX2 的表達(dá)與臨床特點(diǎn)的關(guān)系

表1 顯示SIX2 的表達(dá)與患者的年齡、種族、性別無顯著相關(guān)性（P 均＞0.05）。Logistic 回歸分析同樣顯示SIX2 的表達(dá)增加與腫瘤分期、腫瘤浸潤深度（T）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N）和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M）顯著相關(guān)。具有相關(guān)性。以上結(jié)果表明，SIX2 的過度表達(dá)可能有助于結(jié)腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。見表1。

2.4 生存分析及多因素Cox 分析

所有結(jié)腸癌患者根據(jù)SIX2 的中位表達(dá)水平分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。如圖1C 所示，Kaplan-Meier 曲線顯示SIX2 的高表達(dá)可預(yù)測結(jié)腸癌患者預(yù)后不良（P=0.018）。多因素分析結(jié)果顯示，SIX2表達(dá)與生存時(shí)間顯著相關(guān)（危險(xiǎn)比[HR]：1.83；95%可信區(qū)間[CI]：1.14-2.9；P=0.012），提示SIX2 表達(dá)是結(jié)腸癌患者一項(xiàng)獨(dú)立的預(yù)后因素。其他一些臨床病理特征，如年齡、藥物治療、腫瘤浸潤深度（T）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N），也與預(yù)后不良有關(guān)（圖1D）。

2.5 列線圖預(yù)后模型的建立

如圖1D 所示，年齡、藥物治療、腫瘤浸潤深度（T）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N）和SIX2 的表達(dá)與結(jié)腸腫瘤患者的預(yù)后顯著相關(guān)，這些變量可能是結(jié)腸腫瘤患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)后因素。據(jù)此繪制列線圖來預(yù)測結(jié)腸癌患者的1 年、3 年和5 年生存率（圖1E）。根據(jù)多因素分析中的顯著性因素進(jìn)行評(píng)分，根據(jù)總評(píng)分預(yù)測生存率。

圖1 SIX2 在正常組織和腫瘤組織中的表達(dá)差異（A-B）;SIX2 表達(dá)對結(jié)腸癌患者生存率的影響（C）臨床病理特征與結(jié)腸癌患者預(yù)后的多因素Cox 分析（D）;構(gòu)建列線圖生存模型(E)

3.討論

SIX2 最近被報(bào)道與不同類型的癌癥有關(guān)。Hou 等人[11]使用 qRT-PCR 法檢測NSCLC 中SIX2mRNA 的表達(dá)，Western blot 和免疫組化法檢測SIX2 蛋白水平。他們發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，NSCLC 中SIX2 的表達(dá)水平顯著上調(diào)。然而，SIX2 在結(jié)腸癌中的作用及其機(jī)制尚未得到很好的了解。從TCGA 中下載高通量RNA 測序數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行分析。結(jié)果表明，SIX2 在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)顯著高于正常組織，與腫瘤分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。此外，我們發(fā)現(xiàn)SIX2 的mRNA 表達(dá)增加提示患者不良的預(yù)后，表明SIX2的過表達(dá)可能促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展。因此，我們認(rèn)為SIX2 的表達(dá)水平可以作為結(jié)腸腫瘤的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，是結(jié)腸腫瘤患者預(yù)后不良的獨(dú)立因素。

然而，由于缺乏實(shí)驗(yàn)證據(jù)和臨床數(shù)據(jù)的驗(yàn)證，目前的生物信息學(xué)研究存在一些潛在的局限性。為了驗(yàn)證我們的結(jié)論，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)與研究。