蟬花真菌液體發(fā)酵及活性成分測定

黃小忠　謝春芹　張雪松　凡軍民　許俊齊　陳松玲

摘要：利用蟬擬青霉（Paecilomyces cicadae）菌株進行液體發(fā)酵，并進行單因素和正交試驗，以實現(xiàn)蟬花真菌液態(tài)發(fā)酵條件包括pH值、溫度、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基裝液量的優(yōu)化。結(jié)果表明，蟬花液體發(fā)酵的最優(yōu)條件為pH值7.4、搖床轉(zhuǎn)速 150 r/min、溫度28 ℃、裝液量40%;在此條件下，測得的真菌多糖含量為107.45 mg/g，蟲草酸含量為95.82 mg/g，真菌多糖、蟲草酸含量皆高于天然蟬花。

關(guān)鍵詞：蟬花;液體發(fā)酵;活性成分;測定

中圖分類號： S567.3+50.1;S188+.4

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）02-0197-04

收稿日期：2018-10-29

作者簡介：黃小忠（1981—），男，江蘇海安人，碩士，講師，主要從事發(fā)酵工程研究。E-mail：huangxiaozhong@jsafc.edu.cn。

通信作者：謝春芹，副教授，主要從事食藥用菌研究。E-mail：xiechunqin@jsafc.edu.cn。

蟬花（Cordyceps cicadae），別稱大蟲草，屬蟲生真菌，與冬蟲夏草有非常接近的親緣關(guān)系，屬麥角菌科（Clavicipttaceus）蟲草屬（Cordyceps），在我國，蟬花主要分布在四川省、江蘇省、浙江省、福建省等地[1]。

國內(nèi)外多項研究成果表明，蟬花具有多種保健作用，包括提高人體自身免疫力、抗疲勞、養(yǎng)腎、養(yǎng)肝、改善睡眠、抗腫瘤、抗輻射和明目等，是一味具有神奇效果的古老中草藥[2]。李時珍在《本草綱目》中記載的藥效為：“蟬花可治療驚癇，夜啼心悸，功同蟬蛻”。蟬花的天然成分與冬蟲夏草類似，具有相同的藥用價值，且尚未檢測出有毒重金屬如碘、汞、鉛等，在安全性方面蟬花顯然優(yōu)于冬蟲夏草，同時蟬花的價格相對于冬蟲夏草而言較低，因此蟬花常作為冬蟲夏草的替代品。

蟬花對生長條件要求比較嚴格，需要特定的生態(tài)環(huán)境和寄主昆蟲（金蟬）[3]，這是蟬花資源稀少的主要原因。近幾年隨著生態(tài)環(huán)境的破壞，蟬花的生長區(qū)域大范圍縮小;同時人們開始認識到蟬花的價值，使蟬花遭到了瘋狂的采摘，導(dǎo)致蟬花資源迅速減少。本試驗的目的是利用蟬擬青霉（Paecilomyces cicadae），在經(jīng)優(yōu)化的液態(tài)培養(yǎng)條件下生產(chǎn)蟬花菌絲體，并對菌絲體的生物活性物質(zhì)進行提取及測定分析，以期通過菌絲體發(fā)酵來獲得天然蟬花含有的藥用活性物質(zhì)，為規(guī)模化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 蟬花菌種來源

蟬花（Cordyceps cicadae）菌株來自江蘇省食用菌研究所。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 甘露醇標準品、乙酸銨、冰醋酸、乙酰丙酮、高碘酸鈉、L-鼠李糖、葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、酵母膏、瓊脂、孟加拉紅染色劑、氯霉素、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、高碘酸鉀、苯酚、濃硫酸、無水乙醇。

1.2.2 儀器 水浴恒溫振蕩器;電子天平;立式壓力蒸汽滅菌器;數(shù)顯恒溫水浴鍋;可見分光光度計;冷凍真空干燥機。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 菌種保藏培養(yǎng)基 PDA斜面試管培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，加水至1 L，pH值自然，在121 ℃下滅菌30 min備用。

1.3.2 種子培養(yǎng)基 土豆200 g、蔗糖50 g、豆粕 5 g、KH2PO4 5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g，加水至1 L，pH值自然，在 121 ℃ 下滅菌30 min備用。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基 蔗糖40 g、蛋白胨15 g、KH2PO4 1.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g，加水至1 L，在121 ℃下滅菌30 min備用。

1.4 發(fā)酵種子的制備

1.4.1 菌種活化 將試驗分離所得到的在低溫保藏的蟬花菌種通過無菌操作接種于PDA平板培養(yǎng)基上，在溫度為 28 ℃ 條件下培養(yǎng)2～3 d進行活化，當菌絲長滿整個培養(yǎng)皿時，即可使用[4]。

1.4.2 孢子懸浮液的制備 在無菌條件下，用接種鉤從培養(yǎng)基上取大小約0.3 cm×0.3 cm的母種塊，接種于盛有100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中（菌塊稍帶培養(yǎng)基且要薄，以能浮在培養(yǎng)液表面為最佳），在溫度為28 ℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)72 h[5]。

1.5 液體發(fā)酵條件的確定

1.5.1 發(fā)酵溫度的優(yōu)化 取5 mL菌懸液，接入裝液（發(fā)酵培養(yǎng)基）量為40%的250 mL三角瓶中，將恒溫搖床的溫度分別設(shè)為22、25、28、31、34 ℃，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)為150 r/min，培養(yǎng)5 d后測其生物量。

1.5.2 發(fā)酵pH值的優(yōu)化 取5 mL菌懸液，接入初始pH值分別為6.5、6.8、7.1、7.4，培養(yǎng)基裝液量為40%的250 mL三角瓶中，置于溫度為28 ℃的搖床中以轉(zhuǎn)速為150 r/min的速率進行培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d后測其生物量。

1.5.3 發(fā)酵搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)化 取5 mL菌懸液，接入裝液量為三角瓶中，將搖床的轉(zhuǎn)速分別設(shè)為110、130、150、170、190 r/min，在溫度為28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)5 d后測其生物量。

1.5.4 發(fā)酵裝液量的優(yōu)化 在裝液量分別為20%、40%、60%、80%的三角瓶中接入5 mL菌懸液，置于溫度為28 ℃的恒溫搖床中以轉(zhuǎn)速為150 r/min的速度培養(yǎng)5 d后測其生物量。

1.5.5 正交試驗的確定 選擇溫度、搖床轉(zhuǎn)速、pH值和裝液量為試驗因素，進行4個因素3個水平 L9（34） 正交試驗設(shè)計，對發(fā)酵結(jié)果進行極差和方差分析，探討各種培養(yǎng)條件對蟬花液態(tài)發(fā)酵所獲得的生物量和蟲草酸含量的影響程度。

1.6 測定方法

1.6.1 生物量測定方法 采用細胞干質(zhì)量法[6]測定蟬在液態(tài)發(fā)酵所獲生物量，具體操作為在發(fā)酵液培養(yǎng)完成后，用100目篩過濾得到菌絲體和胞外液，用蒸餾水反復(fù)沖洗菌絲體直至所出濾液澄清為止，將所收集的菌絲體置于玻璃紙上，放入烘箱中，在溫度為60 ℃條件下烘干至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量得生物量。

1.6.2 蟲草酸含量測定 通過微波提取法[7]提取菌絲體中的蟲草酸。利用高碘酸鈉比色法[8]測定蟲草酸含量。

1.6.2.1 微波提取法 取0.05 g干燥液體發(fā)酵菌絲體加入10 mL蒸餾水中在微波爐中通過中火加熱2 min進行微波處理。處理完畢后在3 000 r/min下離心25 min，取上清液加入到50 mL容量瓶中，并用蒸餾水定容。

1.6.2.2 高碘酸鈉比色法 取50 mg甘露醇加入到50 mL蒸餾水中配置成1 mg/mL甘露醇溶液，分別取1、2、3、4、5 mL甘露醇溶液于100 mL容量瓶中，并用蒸餾水定容，得到10、20、30、40、50 μg/mL樣液，取樣液各1 mL，加1 mL高錳酸鉀溶液（加0.15 mol高錳酸鉀于100 mL 0.12 mol/L鹽酸溶液中混勻）。室溫放置10 min，加入2 mL 0.1% L-鼠李糖溶液除去過多的高碘酸鹽。混合后加4 mL新配NaSH試劑（150 g乙酸銨，2 mL冰乙酸，2 mL乙酰丙酮，用蒸餾水稀釋至 1 000 mL），53 ℃水浴加熱15 min使其呈色，冷卻，用蒸餾水代替甘露醇標準液。在波長為412 nm處測吸光度（D412 nm），將測得的吸光度通過回歸方程進行計算，然后通過下式計算菌絲體中蟲草酸的含量[8]。

R=C×V×101 000×m。

式中：R為菌絲體中蟲草酸含量，mg/g;C為提取液中蟲草酸含量，μg/g;10為試樣浸提后定容體積，mL;V為提取液體積，mL;m為試樣的準確質(zhì)量，g。

1.6.3 真菌多糖含量的測定 將干燥后的菌絲體進行前處理。步驟：熱水提取、乙醇沉淀、脫色、去蛋白、低溫干燥。采用硫酸-苯酚法[9]測定真菌多糖含量。

1.6.3.1 前處理 取2 g干燥液體發(fā)酵菌絲研磨成粉末，用水提醇法提取，即加10倍量的蒸餾水，100 ℃水浴煎煮 1 h，重復(fù)3次，過濾提取液，濃縮至1 g ∶1 mL，加3倍量的95%乙醇進行沉淀，5 000 r/min 離心5 min，取上清液，繼續(xù)加95%乙醇放置，傾出上清液，沉淀依次用95%乙醇、無水乙醇洗滌、過濾，低溫干燥24 h，即得多糖粗品。

1.6.3.2 硫酸-苯酚法測定真菌多糖 將提取的多糖樣品置于10 mL容量瓶中，加雙蒸水溶解，并稀釋到刻度線位置，搖勻，備用。標準曲線的制作：吸取葡萄糖標準液（100 μg/mL）0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別加入到各試管中，用雙蒸水補足至每管2 mL，使各管葡萄糖含量分別為0、10、20、30、40、60、80、100 μg。向各管中分別加入0.05 mL 80%苯酚溶液，再加入5 mL濃硫酸（勿沿管壁加入，以便使樣品與硫酸快速混勻），靜置10 min，30 ℃ 水浴15 min。在490 nm波長處測各管的吸光度，以糖濃度為橫坐標，各管的吸光度為縱坐標作標準曲線，作回歸方程曲線，通過以下公式計算真菌多糖含量。

R′=C′×V′1 000×ω。

式中：R′為菌絲體中真菌多糖含量，mg/g;C′為提取液中真菌多糖含量，μg/g;V′為提取液體積，mL;ω為干菌絲體質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟬花生物量的獲得

2.1.1 發(fā)酵溫度對生物量的影響 蟬花真菌在不同溫度下進行液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)的結(jié)果見圖1。對于微生物液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)來說，溫度的影響是雙方面的：隨著溫度升高，可以加速微生物的生長代謝，但是溫度過高不僅會導(dǎo)致微生物體內(nèi)的酶失活還容易使菌體老化，從而影響微生物的正常生長以及代謝產(chǎn)物的積累;溫度過低則導(dǎo)致菌體生長緩慢，因而積累的代謝產(chǎn)物較少。蟬花真菌菌株在溫度為 22～34 ℃ 條件下均能生長，在溫度為28 ℃條件下所獲得的生物量最大，為5.63 g/L。

2.1.2 發(fā)酵pH值對生物量的影響 不同pH值對生物量的影響見圖2。在正常條件下，pH值過低菌體容易衰老，而pH值過高則會導(dǎo)致菌體自溶。本試驗通過設(shè)置不同的pH值來考察蟬花液體發(fā)酵培養(yǎng)的最佳pH值。蟬花真菌在pH值為 6.5～7.7條件下均能生長，生物量隨著pH值的上升出現(xiàn)了先增加后減少的現(xiàn)象，在pH值為7.1時所獲生物量最大，為4.68 g/L。

2.1.3 發(fā)酵搖床轉(zhuǎn)速對生物量的影響 蟬花真菌屬于好氧微生物，菌絲的生長需要消耗氧氣，提高搖床的轉(zhuǎn)速，不僅可以增大液體接觸空氣的面積，還對蟬花真菌的生長有促進作用;轉(zhuǎn)速太小影響通氣量，從而影響溶氧量，不利于菌絲生長;搖床轉(zhuǎn)速超過最佳轉(zhuǎn)速時，由于剪切力增加，菌絲被切斷導(dǎo)致菌絲體難以成形，因此難以維持正常的生長，導(dǎo)致獲得的生物量減少（圖3）。在搖床轉(zhuǎn)速為 150 r/min 時所獲生物量最大，為4.68 g/L。

2.1.4 發(fā)酵裝液量對生物量的影響 不同裝液量對生物量的影響結(jié)果見圖4。裝液量主要影響發(fā)酵過程中的通氣情況，從而影響菌絲體的生長，裝液量過小導(dǎo)致培養(yǎng)基水分蒸發(fā)較快，代謝物濃度較大，溶氧量下降;裝液量過大會使振蕩效果減弱，溶氧量降低。蟬花真菌液態(tài)發(fā)酵最佳裝液量為40%，此時生物量為5.37 g/L。

2.2 蟬花真菌最佳液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件

選擇溫度、裝液量、搖床轉(zhuǎn)速、pH值為試驗因素，因素水平表見表1。

正交試驗優(yōu)化結(jié)果見表2，影響蟬花真菌液態(tài)發(fā)酵生物量的各因素主次為A>C>D>B，即溫度對蟬花真菌液態(tài)發(fā)酵過程中生物量的影響最大，搖床轉(zhuǎn)速次之，pH值再次之，裝液量對生物量的影響最小。根據(jù)表2直觀分析最佳發(fā)酵條件為A2B1C2D3， 該條件下發(fā)酵液中的生物量為6.13 g/L。

蟬花真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)的最佳條件：溫度為28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，pH值為7.4，裝液量為40%。

2.3 蟬花菌絲體中的活性成分測定

2.3.1 蟲草酸含量標準曲線的制備 根據(jù)高碘酸鈉比色法，作蟲草酸（D-甘露醇）含量的標準曲線（圖5）。蟲草酸含量的回歸方程：y=0.004 0x+0.003 2。根據(jù)“1.6.2”節(jié)中的方法得到的樣品吸光度為 0.572，蟲草酸含量為95.82 mg/g。

2.3.2 蟬花真菌多糖含量標準曲線的制備 根據(jù)硫酸-苯酚法，作真菌多糖標準曲線（圖6）。真菌多糖含量的回歸方程：y=0.067 5x-0.014 0。根據(jù)“1.6.3”節(jié)中的方法得到的樣品吸光度是0.497，真菌多糖含量為107.45 mg/g。

3 結(jié)論與討論

本研究通過對蟬花真菌進行液體發(fā)酵工藝優(yōu)化試驗發(fā)現(xiàn)，蟬花真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)的最佳條件是溫度為28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，pH值為7.4，裝液量為40%。

文欣等發(fā)現(xiàn)，在改良的液體發(fā)酵條件下得到的蟬花菌絲生物量為 5.72 g/L，真菌多糖含量為86.71 mg/g，蟲草酸含量為 90.13 mg/g[10]。黃小忠等在改良的液體發(fā)酵培養(yǎng)基條件下，得到的蟬花菌絲生物量為5.63 g/L，真菌多糖含量為88.73 mg/g，蟲草酸含量為82.58 mg/g[2]。本研究在使用改良液體發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了發(fā)酵工藝，所獲得的生物量為 6.13 g/L，真菌多糖含量為107.45 mg/g，蟲草酸含量為 95.82 mg/g。3項指標皆明顯提高，在發(fā)酵中所獲得的蟬花菌絲體活性物質(zhì)與天然蟬花中活性物質(zhì)相同，但蟬花菌絲體中的天然有益物質(zhì)真菌多糖和蟲草酸的含量均高于天然蟬花，天然蟬花真菌多糖含量為33.2 mg/g，蟲草酸含量為53.6 mg/g[11]。因此將蟬花液體發(fā)酵菌絲體用于保健用品開發(fā)，以替代天然蟬花的使用不無可能，此方法不僅可以降低生產(chǎn)成本，也可減少對天然蟬花資源的破壞。

本研究對蟬花液體發(fā)酵條件進行了考察，優(yōu)化了蟬花液體發(fā)酵工藝條件。后續(xù)還將會對蟬擬青霉菌種進行選育考察，同時將繼續(xù)研究和改良發(fā)酵培養(yǎng)基的配方，在打破傳統(tǒng)配方的基礎(chǔ)上，尋找更適合蟬花發(fā)酵的碳源、氮源等材料，從而進一步優(yōu)化蟬花發(fā)酵工藝。

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