基于聚類分析及因子分析對急性腸粘膜損傷大鼠背部敏化區域Evans Blue滲出強度及規律的分析＊

林 燊，林 棟＊＊，王芳玲，洪 霖，齊詩儀，莫毓昌

（1. 福建中醫藥大學針灸學院 福州 350122；2. 華僑大學數學科學學院 泉州 362021）

穴位即腧穴，亦稱之為“孔穴”“刺激點”，在《內經》中有“以痛為腧”“以手疾按之，快然乃刺之”的記載，是臟腑-經絡關系中的重要環節之一。穴位是人體生理、病理狀態呈現于體表皮膚的重要部位，在臨床疾病的診斷和治療過程中，產生敏化現象的穴位具有更為特殊意義[1]。穴位敏化概念自二十世紀八十年代提出后，正逐步成為穴位研究熱點之一[2,3]。有研究發現[4]，穴位的功能強弱是隨著機體功能變化而動態改變，在“沉寂態”與“激活態”之間轉化[5]。而關于體表穴位分布規律的研究，是穴位敏化研究中關注相對較少的薄弱環節，尚欠缺進一步的科學闡釋[6]。目前,有關敏化穴位分布規律的研究已取得初步結果，有研究通過觀察發現急性心肌缺血模型大鼠的腹部和四肢幾乎未見Evans Blue 滲出，而在脾、胃俞、心俞的Evans Blue 滲出點較為密集[7]。同時,亦有研究發現冠心病心絞痛患者體表牽涉痛部位及穴位敏化點的位置分布與脊柱T1～T5 神經節段所支配的皮表區域相關[8]。為進一步探索與分析體表敏化穴位分布特征及規律性，本研究擬觀察急性腸粘膜損傷模型大鼠背部Evans Blue 滲出點的分布情況，并通過基于探索性空間統計分析技術的經緯網格計數法以及多元統計分析技術[9]深入探索穴位敏化分布規律。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組

本實驗采用SPF 級體重為200～220 g 的雄性SD大鼠，許可證號：SYXK（閩）2014-005。每籠6只，給予自然照明、自由飲水和攝食。實驗時室溫保持恒定。將30 只SD 大鼠按不同芥子油濃度分為5%、7.5%、10%、12.5%、15%濃度，共五組，每組6 只。實驗過程中，嚴格遵循實驗動物倫理規范操作，實驗結束后過量麻醉處死。

1.2 急性腸粘膜損傷模型制備

造模前動物禁食20小時，不禁水，自由活動，室溫保持在（20±1）℃，灌腸前，按摩腹部以刺激排出3-4粒糞便后將大鼠倒置，用18號直頭灌胃針由肛門進入大鼠腸道約8 cm，按實驗分組注入提前用石蠟油稀釋的不同濃度芥子油（5%、7.5%、10%、12.5%、15%）各0.5 ml，注射后保持大鼠倒置姿態1分鐘，模型制備完畢[9]。

1.3 Evans Blue注射

各組大鼠在腸道灌注芥子油造模后4 小時注射10%的水合氯醛注射（4 ml/kg）麻醉，先用電動剃毛器除去大鼠背部的被毛，再用脫毛劑去除殘留的被毛，操作應盡量避免皮膚損傷造成假陽性點滲出。隨后尾靜脈注射Evans Blue（5 mg/100 g，50 mg/ml溶于生理鹽水中），觀察大鼠背部Evans Blue滲出點，其以隱于皮下的淡藍色滲出點為準，而在表皮顏色鮮艷的滲出點大多是由于實驗過程中的體表皮膚損傷導致。研究者分別在造模完成后5小時、10小時、15小時、20小時、25小時五個時間點拍照記錄大鼠背部的EB滲出情況[9]。

1.4 經緯網格計數法

1.4.1 動物定標

在鼠臺上標定鼻尖、耳根、尾根的位置，將大鼠按標定位置俯臥固定在鼠臺上，采用三維支架標定拍攝高度為38 cm，于造模后五個時間點進行拍照。

1.4.2 建立經緯網格坐標系

本研究以大鼠第一胸椎為原點建立平面直角坐標系，在坐標系內構建5 mm×5 mm 的經緯網格（項目組前期研究發現大鼠各棘突間距大約為5 mm）[9]。坐標系中X 軸由原點向左依次設為11、12、……、16，向右設為1、2、……、6；Y 軸由原點向下依次設為A、B、C、D、……、U、V，將大鼠背部區域分為 264 個網格（A1、……、A6、A11、……、A16、……、V15、V16）[9]（見圖1）。

1.4.3 計數

圖1 建立大鼠經緯網格定標圖

將5 mm×5 mm 經緯網格以A1……A6、A11……A16……V15、V16 命名。完整在一個方格內的隱于皮膚之下的Evans Blue滲出點計數為1，參考程斌等研究報道[10]。若Evans Blue 滲出點顏色鮮艷則是假陽性點，由于實驗過程中大鼠皮膚損傷所致，不納入統計；若Evans Blue 滲出點在經緯網格相鄰處，跨越兩個或多個格子，以記上不記下，記右不記左為原則，對各網格區域內點的統計（見圖2）[9]。

1.5 統計學處理

1.5.1 方法一

本研究通過聚類分析中的R 型聚類法（指標聚類）獲得與EB 滲出強度相關的“特征網格”，并對該“特征網格”的滲出強度與病情、病程的相關性開展輪廓分析[11]。其中，R 型聚類法主要通過經緯網格構建獲得網格坐標及EB 滲出點個數，并將數據錄入SPSS后，根據聚類級別得到有意義網格坐標后，還原到大鼠背部網格坐標中。而輪廓分析的統計方法對兩組或多組變量均數向量的輪廓開展分析[12]。本研究針對聚類分析中獲得的“特征網格”開展隨濃度和時間分布的平行輪廓、重合輪廓、水平輪廓檢驗，檢驗觀察指標的變化趨勢是否相同、均數是否相等、是否呈線性相關。

1.5.2 方法二

針對不同時間及不同濃度的EB 滲出強度，逐一開展因子分析，從而獲得在不同時間及濃度參數下的EB 滲出強度相關“特征區域”。再對其開展后繼的輪廓分析驗證，進一步判定其滲出“特征區域”的變化趨勢[11]。

圖2 Evans Blue滲出計數點

本研究的因子分析及主成分分析的意義，在于進一步開展對敏化位置體表滲出強度的區域分析，相較于聚類分析的單網格特征，因子分析及主成分分析具有強大的空間分辨能力。因子分析法選取累計貢獻率大于60%的主成分數為因子數，同時其特征根值必須大于1，并通過旋轉變換，尋找最佳公因子。因子分析經多次旋轉迭代產生的一個以網格為計數單位的因子，形成不同的因子1、因子2、因子3 等，每個因子內皆有若干個網絡坐標，根據可提取因子數中的相關網格坐標組成特征區域，并且還原到經緯網格中分析其分布規律與特征，繼而同樣采用輪廓分析的方法對上述“特征區域”開展與病情及病程相關的趨勢分析。

2 結果

2.1 造模情況

造模后，部分大鼠排膿血便且肉眼可見，部分大鼠造模后自主收縮下肢、舔舐下肢或臀部，部分大鼠出現萎靡倦怠、毛發戰栗、對外界反應觸碰反應強烈、肛門周圍紅腫，部分大鼠眼睛、鼻子等部位出血。這說明實驗動物急性腸粘膜損傷造模成功，在造模后25小時內5%、7.5%、10%、12.5%、15%芥子油大鼠均存活。

2.2 體表EB滲出點聚類分析結果

根據大鼠背部各個網格所采集的有效Evans Blue滲出點數量輸入SPSS數據視圖，對所有數據進行R型聚類，得到樹狀分布圖（見圖3）。

圖3 聚類分析結果樹狀分布圖

根據聚類分析結果，選取圖3 全因素聚類分析中最具有特征意義的前4“類”，即如圖4 所示的四個“特征網格”，說明這四個點的滲出行為在不同時間及不同濃度的組別中具有較強的特征性。

將其中的網格坐標還原至大鼠背部經緯網格坐標圖，可以看出在不同濃度不同時間觀察的EB 滲出強度，主要分布于急性腸粘膜損傷大鼠胸腰段的脊柱兩側（見圖4）。

2.3 “特征網格”的輪廓分析結果

通過運用輪廓分析驗證聚類分析所得四個“特征網格”（S1、N1、O14、L11）隨濃度或時間變化而存在的趨勢，其結果如圖5所示。

上述結果表明，在不同濃度下“特征網格”的EB滲出行為與時間變化的平行輪廓檢驗結果P＞0.05，說明在不同濃度芥子油下，“特征網格（4 個）”的Evans Blue 滲出行為未呈現時間變化趨勢；重合輪廓檢驗結果P＞0.05，說明“特征網格”在不同時間點的滲出程度相同，無統計學差異。

圖4 全因素R型聚類結果與特征網格分布

圖5 “特征網格”在各時間點上不同濃度芥子油模型大鼠的EB滲出強度輪廓分析

在不同時間點“特征網格（4 個）”的Evans Blue 滲出行為隨濃度變化的平行輪廓檢驗結果P＞0.05，說明各時間點的“特征網格”的滲出行為未呈現隨濃度變化趨勢；重合輪廓檢驗結果P＞0.05，說明“特征網格”在不同濃度下的滲出程度相同，無統計學差異，如圖6所示。

2.4 體表EB滲出強度的因子分析結果

因子分析在不同濃度、不同時間結果中存在的“特征區域”見表1，其“特征區域”還原結果如圖8、圖9。

通過網格坐標還原可發現因子1中各坐標分布具有集中趨勢，而因子2 及因子3 的集中趨勢減弱呈分散狀（如圖7所示）。考慮到若干相鄰網格集合成的區域且范圍不宜太大，所包含有效指標約在3-5 個之間（如表1）。研究發現，所謂有意義因子所組成的“特征區域”，即如因子1 中網格坐標有著有比較典型的“組點成區”的趨勢，而該趨勢在因子2 與因子3 中則不存在。

按上述方法，在不同濃度、不同時間點下的“特征區域”結果如圖8、圖9所示。

2.5 “特征區域”的輪廓分析結果

通過輪廓分析驗證因子分析結果所得“特征區域”隨濃度或時間變化的趨勢，其結果如圖10、圖11所示。

上述結果表明，不同濃度下Evans Blue 滲出特征區域在不同時間中的變化規律：平行輪廓檢驗（P＞0.05），表明特征區域EB 滲出行為具有隨時間變化的趨勢；重合輪廓檢驗（P＞0.05），表明特征區域隨時間變化的EB滲出程度相同，無統計學差異。

上述結果表明，各時間點EB 滲出特征區域在不同濃度下的變化規律：平行輪廓檢驗（P＞0.05），表明不同濃度下的差值都在一個固定范圍內，即特征區域EB 滲出行為具有隨濃度變化的趨勢；重合輪廓檢驗（P＜0.05），表明不同濃度下的評分均值不相等，即特征區域EB 滲出程度隨濃度變化不相同，其結果具有統計學意義。

圖6 “特征網格”在不同濃度芥子油模型大鼠中各時間點的EB滲出強度輪廓分析

圖7 5%濃度的滲出區域特征分析

表1 因子分析后不同濃度及不同時間下的“特征區域”

圖8 因子分析后不同芥子油濃度下特征區域分布范圍

圖9 因子分析后不同時間點上特征區域分布范圍

圖10 特征區域在不同時間點中各濃度芥子油模型大鼠的EB滲出強度輪廓分析

圖11 “特征區域”在不同濃度芥子油模型大鼠中各時間點的EB滲出強度輪廓分析

3 討論

3.1 基于經緯網格計數法的EB 滲出強度體表分布規律研究

現階段對于病理狀態下敏化穴位動態性分布的研究主要有兩方面[7,10,13-15]：一方面是按照不同脊柱神經節段分布，觀察疾病模型動物體表Evans Blue 滲出點所處神經節段與該節段內Evans Blue 滲出數量，說明當臟腑發生病變，其相應神經節段所支配的皮膚區域出現Evans Blue 滲出點。另一方面是按照傳統腧穴分布，觀察疾病模型動物背部與四肢區域Evans Blue滲出點，并通過公式“在穴位處出現EB 滲出點的動物只數/模型組的動物只數×100%”得出Evans Blue 滲出在穴位處分布的比例，進而判斷臟腑疾病與傳統腧穴之間的相關性。然而，現階段關于穴位敏化的研究尚不能表明具有動態性的敏化穴位[16,17]，雖然已有研究涉及神經生物學效應，而對于體表分布特征的腧穴表述方面研究仍相對欠缺[18,19]。

本研究采用經緯網格計數法統計急性腸粘膜損傷大鼠背部Evans Blue 滲出情況，并結合多元統計分析開展研究。本研究中所使用的經緯網格計數法是基于現代計量地理學中的空間統計分析思路,即空間數據（spatial data）統計分析方法[20]。通過繪圖軟件建立一個以大鼠背部第一胸椎為原點的平面坐標系，并賦予每個網格相應的坐標名稱（如A1、A2），將每一個網格作為一個計數單位。通過經緯網格坐標在大鼠背部Evans Blue 滲出點與大鼠背部體表位置之間構建了可以判斷參照分析的二維平面坐標系。本實驗基于坐標體系對模型大鼠Evans Blue 滲出點分布特征進行提煉分析，觀察各個經緯網格內Evans Blue 滲出點個數（即滲出強度），運用SPSS 22.0統計滲出強度并展開多元統計分析。

(1)基坑的周圍具有一個邊界效應,即在基坑外的濕陷量量會迅速的減小，而基坑內部中心點沉降量最大，其沉降量沿半徑方向較為均勻的減小。

3.2 經緯網格計數法與穴位敏化的“區域性”特征

本研究通過不同濃度、不同時間下的EB 滲出點聚類分析獲得特征網格，再通過輪廓分析驗證各特征網格隨濃度或時間變化的趨勢，其結果無明顯特異性，說明單一個體的“特征網格”無顯著的隨疾病病情及病程變化趨勢。本研究發現通過聚類分析所得結果僅僅提示穴位敏化可能存在一定趨勢性，而通過觀察大鼠背部的EB 滲出點分布發現，不僅單個網格（5 mm×5 mm）存在是有意義的，相鄰的若干網格組合也可能是敏化陽性區域的分布（面積大于5 mm×5 mm 的多網格組合），即穴區。因此，本研究采用因子分析手段對前期獲得的數據，進一步開展了“群”或“類”的統計探究，根據結果匯總因子貢獻度及因子系數的差異進行篩選并組成網格“集合”。與單網格點的聚類分析相比，因子分析得到的公因子所表現出滲出行為特點差異顯得更為顯著。因此，區域性變量將由獨立的單個網格組成“集合”，更能突出其滲出行為的特點和規律性，并且Evans Blue 滲出數量隨著病情變化而發生動態改變，上述研究揭示了敏化穴位分布的動態性過程，有助于判斷滲出行為與臟腑疾病的相關性[9]。

通過多元統計分析表明，“特征區域”存在與濃度相關的變化規律特征，即與疾病病情相關。而區域性變量（集中、范圍較大）較之單坐標變量（單個網格）似乎更能體現規律性的滲出特征，盡管現階段的研究結果仍不足以體現其與病程、病情相關的規律性，但已能從某些區域的分布行為中發現一絲端倪。

3.3 敏化區域與病情的相關性

現今關于穴位敏化的研究大多關注疾病過程中的某一階段，而對于隨病情及病程變化的疾病動態性研究關注較少。敏化穴位的發生不僅與疾病共同存在，而且是疾病變化特征（病情、病程）的主要表現形式之一。有研究者認為敏化穴位的分布規律不僅與疾病病程（時間）相關[21]，還與病情（程度）相關[22]。亦有學者發現在不同病理狀態下穴位敏化都能表現出與病情相關的變化關系，并且在疾病過程的不同階段所呈現的特點有所差異[22]。陳日新等[23]對臨床多種常見疾病的熱敏灸治療發現，局部腧穴的熱敏發生率會隨著疾病的痊愈而下降。程斌等[10]通過動物實驗發現急性胃粘膜損傷相關的體表EB 滲出點與內臟神經節段分布高度相關，并且EB滲出呈現與疾病病情相關。

通過還原經緯網格坐標所獲得“特征區域”，可能是急性腸粘膜損傷有關的敏化穴位分布區域，本研究接著通過輪廓分析進一步分析“特征區域”是否存在隨濃度或時間變化而變化的趨勢。研究發現，“特征區域”在不同時間點存在隨濃度變化的趨勢，且變化程度不相同，而在不同濃度下隨時間變化的趨勢及變化程度尚不顯著。結果表明，芥子油濃度為7.5%時EB 滲出強度在各時間點均可達到峰值。其后隨著芥子油濃度增加，Evans Blue 滲出強度回落并呈現較平穩變化趨勢。因此，盡管敏化穴位可隨病情變化而發生改變，即在疾病的不同階段或狀態下所呈現出不同的敏化狀態，但是其敏化進程隨疾病狀態而存在一個臨界值（峰值），達到峰值后即使病情繼續加重，其敏化進程也未見顯著性變化。

3.4 敏化“特征區域”與穴位分布相關性

腧穴是人體在生理或病理狀態下能與相應臟腑結構發生交互并發揮個性和/或共性效應的體表區域[24]。本研究結果表明，急性腸粘膜損傷后大鼠背部EB 滲出點主要集中在大鼠胸段和腰段脊柱兩側（圖12 中紅色散點），與大鼠腧穴分布（圖12 中藍色陰影）具有一定相關性。通過多元統計分析所得特征區域主要集中分布于大鼠背部T10～T12段與L1～L2段脊柱兩側，其次在上背部T3、T4 段脊柱右側有分布趨勢（如圖12），其特征區域分布與大鼠體表穴位[26,27]中的肺俞、脾俞、腎俞定位相近。

4 總結

圖12 急性腸粘膜損傷大鼠背部“特征區域”集中分布與常規大鼠穴位比較

本研究通過構建基于經緯網格計數法的大鼠體表定位體系，采用聚類分析及因子分析的研究方法對以網格為最小計數單位的體表區域展開多元統計分析，從而提取及分析體表EB 滲出點的數學分布特征。今后本研究團隊將進一步開展與數學計算機學院的多學科交流合作，逐步引入Spatial Data 統計分析技術，開展基于多值預測的體表穴位敏化分布規律研究。